农杆菌介导的杜梨叶片瞬时转化方法的建立

【目的】探寻一种由农杆菌介导的杜梨叶片瞬时转化的最佳方法。【方法】以杜梨组织培养的幼嫩叶片为材料，将含有GUS基因的pBI121植物表达载体转化农杆菌GV3101和EHA105，设计3因子3水平正交试验L9（33），采用不同农杆菌菌液浓度、不同真空渗入时间，侵染叶片组织细胞，取不同时间共培养后的叶片观察GUS染色情况。【结果】GV3101和EHA105均能高效侵染转化杜梨叶片，使GUS蛋白表达，但其转化效率不同。农杆菌GV3101在菌液OD600为0.8，真空渗入20min，共培养4d后，杜梨叶片的转化效率即可达到100%，且叶片坏死率仅为13.09%；EHA105在OD600为0.8，真空渗入30min，共培养6d，或菌液OD600为1.0，真空渗入10min，共培养2d的条件下转化效率最高，均为83.33%，但是，叶片坏死率分别为27.78%和15.26%，然而在菌液OD600为1.0，真空侵染时间20min，共培养4d后，叶片转化效率为75.79%，但叶片坏死率大大降低，仅为5.00%。【结论】菌株GV3101和EHA105均能高效侵染转化杜梨叶片，最高转化效率分别为100%和83.33%，所以菌株GV3101转化效率高于EHA105。考虑到叶片坏死率，菌株GV3101瞬时转化杜梨叶片的最适条件为：菌液OD600为0.8，真空渗入时间20min，共培养4d，转化效率100%，叶片坏死率13.09%；菌株EHA105瞬时转化杜梨叶片的最适条件为：菌液OD600为1.0，真空渗入20min，共培养4d，转化效率75.79%，叶片坏死率5.00%。