‘赤霞珠’葡萄果实中儿茶素没食子酰基化 转移酶蛋白的纯化与鉴定

摘要：【目的】对参与‘赤霞珠’葡萄果实中催化1-O-β-D-没食子酰葡萄糖（1-O-β-D-glucogallin，βG）和表棓儿茶素 （Epigallocatechin，EGC）生成表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）相关儿茶素没食子酰基化 转移酶（epicatechin: 1-O-galloyl-β-D-glucose O-galloyltransferase，ECGT）蛋白进行纯化与鉴定。【方法】以安徽萧县葡萄 园种植的‘赤霞珠’葡萄果实为材料，采用丙酮沉淀、硫酸铵分段盐析、亲和柱层析、羟基磷灰石柱层析及Superdex200 凝胶过滤色谱方法对 ECGT 酶蛋白进行分离与纯化，基于高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）技术测定以上各步纯化后获得的ECGT酶蛋白的比活力，并采用SDS-PAGE（SDS-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳对Superdex200凝胶过滤色谱纯化后获得酶蛋白进一步分离与纯化，然后基于高效液相色 谱-电 喷 雾 质 谱 联 用 技 术（HPLC-electrospray ionization mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）对 目 的 条 带（55 ku，28 ku）进行鉴定；另外，进一步采用定量反转录-聚合酶链式反应（quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术对预测的ECGT酶蛋白相关基因及其上游3个糖苷转移酶基因（glucosyltransferase GT1-3）在果实不 同发育时期的表达水平进行研究。【结果】以上蛋白纯化技术均能有效纯化ECGT酶蛋白，获得的ECGT酶蛋白比活力 分别为0.32、3.14、11.78、31.80和88.82 U·mg^-1 ，纯化倍数分别为9.81、36.81、99.38和 277.56倍，酶活总回收率分别为 83.33%、4.64%、0.96%和0.13%。对酶蛋白2条目的条带鉴定结果表明，丝氨酸羧肽酶-类酰基转移酶（serine carboxypeptidase- like acyltransferases，SCPL acyltransferases）家族中一条酶蛋白（XP_002272116.1）比对的分值均最高。此酶 蛋白的相关基因SCPL及其上游相关3个基因GT1-3表达均与‘赤霞珠’葡萄果实发育呈显著负相关。【结论】‘赤霞珠’葡 萄果实存在ECGT酶蛋白，属于SCPL类酰基转移酶家族，且可能以基因簇的方式行使其功能。