PDF 【目的】呼吸爆发氧化酶（respiratoryburstoxidasehomologprotein，RBOH）是一种酶复合物，其催化作用受RBOHs关键合成基因的限制，同时与氧气消耗的突然增加、活性氧（ROS）积累关系密切，在调控植物的各种发育过程和应激反应中发挥着关键作用。构建盐胁迫下葡萄酵母核文库系统，以探索RBOH基因参与葡萄应对非生物胁迫等分子调控机制。【方法】以150mmol·L-1NaCl溶液对6年生的巨峰葡萄进行浇盐处理，12h后收集葡萄根、茎、叶和果实样品，采用Gateway技术构建酵母单杂交（yeastone-hybrid，Y1H）核文库系统；使用血细胞计数器计量文库酵母滴度。利用Y1H和高通量测序技术（next-generationsequencing，NGS）筛选互作蛋白。在氨基酸缺陷培养基中添加3-氨基-1,2,4-三唑（3-amino-1,2,4-triazole，3-AT）对启动子进行自激活验证和浓度筛选。使用基因本体论注释（geneontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）数据库对筛选基因进行富集分析和注释。【结果】容量检测结果显示，该文库酵母滴度为1.4×109CFU·μg（-1菌落形成单位），插入片段长度500~2000bp，重组率为100%。成功分离出长度为1070bp的VvRBOHA启动子序列，并通过在线工具预测该序列具有多个顺式作用响应元件结合位点，包括多种激素如脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯，盐胁迫响应元件，以及MYB和W-box结合位点；利用该启动子筛选出1516个候选互作靶蛋白，其中转录因子有278个，激酶相关蛋白达405个。随机克隆8个高通量测序读数较高的候选蛋白并进行酵母回转验证试验，结果显示所有蛋白质与VvRBOHA启动子存在相互作用，表明利用该文库进行酵母单杂交筛选候选蛋白效率较高。【结论】成功构建了具有大容量和合适插入片段的酵母杂交文库，并利用该文库进行酵母单杂交筛选候选蛋白效率较高，并成功鉴定出与VvRBOHA启动子存在相互作用的多个候选转录因子。以上研究成果为葡萄应对非生物胁迫的调控策略开辟了新思路。