山核桃miR159家族成员进化特性分析及功能研究

【目的】了解山核桃miR159家族成员的进化特性以及在植物花发育过程中的作用。【方法】通过PsRNATarget软件预测cca-miR159的靶基因，利用生物信息学软件对其进行系统进化及miR159成熟体碱基保守性分析；采用5’RACE技术验证cca-miR159对靶基因的裂解作用；以山核桃的雌雄花芽为试验材料，利用PCR技术扩增cca-miR159前体序列，通过转基因技术得到转基因阳性植株并对其基因功能进行验证，并通过荧光定量PCR分析转基因植株中miR159靶基因的表达情况。【结果】在山核桃中成功克隆了miR159的2种前体序列，分别为cca-miR159.1和ccamiR159.2。其中cca-miR159.1前体序列中只含有1个cca-miR159a成熟体，而cca-miR159.2前体序列中含有ccamiR159a和cca-miR159b2个成熟体，且cca-miR159a碱基保守性明显高于cca-miR159b。进化分析发现山核桃miR159前体序列与杨树的亲缘关系较近。预测到cca-miR159a的靶基因主要为MYB家族基因，而cca-miR159b的靶基因则为AP1和UBX，分别对花发育以及生长素的调节有影响。进而对靶基因的切割位点进行验证，发现cca-miR159的靶基因切割位点基本在第11和12位碱基之间。过表达cca-miR159.1的拟南芥阳性植株叶片数量少于野生型，而过表达cca-miR159.2的阳性植株，除了叶片数量减少，其花期较野生型提早10d左右。【结论】山核桃miR159含有ccamiR159a/b2个成熟体，它们主要在靶基因的第11与12位碱基之间进行剪切。cca-miR159a的靶基因主要为MYB家族基因，其中MYB33、MYB65促进花药与花粉发育。cca-miR159抑制靶基因的表达从而发挥作用，cca-miR159.1过表达对植株的生长有一定的抑制作用，cca-miR159.2具有促进植物花期提前的作用。