梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立

摘要：【目的】将叠氮溴化丙啶（PMA）与实时荧光定量PCR技术（qPCR）相结合，建立一种快速检测梨火疫病菌活菌 的方法，为病害的检疫和早期诊断，开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌（Erwinia amylovora）质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1，通过优化PMA的质量浓度和 曝光时间，确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件，再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系，验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×108 CFU·mL^-1 、 PMA浓度为25 μmol·L^-1 、曝光时间为10 min时，能完全抑制死菌的扩增，仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%~100%时（浓度为6.0×107 ~6.0×108 CFU·mL^-1 ），PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一 个数量级，二者存在良好的线性关系（R² =0.992 8）。灵敏度检测结果表明，6.0×103 ~6.0×108 CFU·mL^-1 范围内，梨火疫 病菌活菌数与Ct值线性相关（R2 =0.994 7），检测灵敏度下限为6×103 CFU·mL（-1 12 CFU/qPCR反应）。用建立的PMAqPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条，PMA-qPCR能准确检测其中的活菌，结果与菌落计数结果相 符。【结论】本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量，具有灵敏、准确和高效的优点，避 免了常规qPCR检测死菌导致的“假阳性”。