豆梨中谷胱甘肽还原酶基因的分离、表达特点及酶活性分析

摘要：【目的】测定谷胱甘肽还原酶活性变化, 结合其催化产物含量、编码基因表达特点分析, 明确该酶是否参与豆梨应对镉胁迫的调控过程。【方法】采用紫外/可见分光光度法检测谷胱甘肽还原酶 (glutathione reductase, GR) 活性、谷胱甘肽池组成及过氧化氢 (hydrogen peroxide, H2O2) 含量, RT-PCR和PCR克隆PcGRchl和PcGRcyt的cDNA和DNA序列, 利用生物信息学方法进行序列比较分析, 荧光定量PCR检测它们在镉胁迫下转录水平变化。【结果】镉胁迫情况下, 豆梨叶片GR活性上升, 谷胱甘肽池中总谷胱甘肽 (total glutathione, T-GSH) 和还原型谷胱甘肽 (reduced glutathione, GSH) 减少、氧化型谷胱甘肽 (oxidized glutathione, GSSG) 上升, H2O2积累增加。豆梨叶绿体PcGRchl和胞质PcGRcyt的序列长度、基因结构及所编码蛋白特征各不相同, 它们在豆梨叶片中的表达量上调以响应镉胁迫信号, 以PcGRchl的转录占主导。外源GSH预处理有助于豆梨预先储存GSH, 减缓镉胁迫下H2O2的积累, 与Cd (2 mmol·L-1CdCl2·2.5H2O+Hoagland营养液) 组相比较, GC (2 mmol·L-1, GSH预处理12 h转入2 mmol·L-1CdCl2·2.5H2O+Hoagland营养液) 组PcGRchl和PcGRcyt的表达水平没有太大变化,但GR活性部分受抑制;外源BSO预处理抑制植株叶片GSH合成,镉胁迫下BC(2 mmol·L-1丁硫氨酸-亚砜亚胺预处理12 h转入2 mmol·L-1CdCl2·2.5H2O+Hoagland营养液) 组H2O2产生加剧, GR活性上升幅度变大, 但PcGRchl和PcGRcyt的转录不受影响。上述结果表明, GSH预处理或BSO预处理, 可改变豆梨叶片GSH池的组成, 从而在蛋白质水平上反馈调节镉胁迫情况下GR活性。【结论】豆梨GR参与应对镉胁迫的调控过程。镉处理后, 豆梨叶片中GSH减少, 促使GR酶活性上升, 以补充植株应对逆境所需GSH, 这一过程主要通过叶绿体PcGRchl的转录上调来实现;GSH或BSO预处理, 改变植株GSH含量, 从而影响GR活性, 减缓或加剧镉胁迫下H2O2的产生, 这一过程主要是在GR基因翻译后的蛋白水平上进行反馈调节。