豆梨NADH型硝酸还原酶基因克隆、表达及酶活性分析

【目的】克隆豆梨硝酸还原酶基因（PcNR）,并对其序列特征、表达特点及酶活性进行分析。【方法】采用电子克隆、RT-PCR和长片段PCR,得到PcNR的cDNA和DNA序列,利用生物信息学方法进行序列分析,半定量RT-PCR检测其表达特点,并测定硝酸还原酶活性。【结果】获得了豆梨硝酸还原酶基因（PcNR）的cDNA编码区,其长度为2 712 bp,编码903个氨基酸,对应的基因组DNA序列长4 115 bp,包括4个外显子和3个内含子。PcNR编码的多肽含有硝酸还原酶特征序列:含钼因子、血红素结合区域和FAD绑定区域,属于NADH型硝酸还原酶。PcNR与湖北海棠MhNR（JN632526）、桃PpNR（AB061670）和野草莓FvNR（XM₀04300392）蛋白间的相似性较高,并与蔷薇科植物NR处于系统进化树的同一分枝上。在无氮处理的豆梨叶片中几乎检测不到PcNR的表达;随着培养液中NO3-浓度的提高,其表达量先上升后下降;此外,供氮时间、环境温度及光照均可调控该基因的表达。豆梨叶片中硝酸还原酶的活性变化规律与PcNR表达量变化趋势相一致。【结论】首次从豆梨中克隆获得PcNR基因的cDNA和DNA序列,揭示了其序列特征,并对调控该基因表达和硝酸还原酶活性的相关因素进行分析,为开展梨砧木氮素营养研究提供资料。