酿酒葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

摘要：【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物，在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0 ℃，采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒，即葡萄病毒A（Grapevine virus A，GVA）、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus，GFKV）、葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV）、葡萄卷叶病毒1（Grapevine leafroll associated virus- 1，GLRaV-1）、葡萄卷叶病毒2（Grapevine leafroll associated virus-1，GLRaV-2）和葡萄卷叶病毒4（Grapevine leafroll associated virus-4，GLRaV-4）。在此基础上，对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合，建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示，退火温度为49 ℃、55 ℃和60 ℃时，可分别检测GVA和GLRaV、GLRaV和GFKV以及GFLV和GLRaV。多重RT-PCR结果显示，退火温度分别为49 ℃和55 ℃时，引物GVA和GLRaV-2以及引物GLRaV-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRaV以及GLRaV和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒，部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中，5份样品为GVA阳性，8份为GLRaV-1阳性，3份为GLRaV-2阳性，5份为GFKV阳性，所有样品均未检测到GFLV和GLRaV-4。退火温度分别为49 ℃和55 ℃时所建立的GVA和GLRaV以及GLRaV和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系，可同时有效地检测GVA和GLRaV-2或GLRaV-1和GFKV，可用于田间葡萄样品的快速检测。