猕猴桃（Actinidia chinensis）是一种具有高营养价值和经济价值的水果，因其营养丰富、味道鲜美，深受消费者青睐[1]。然而，贮藏过程中由病原感染引起的病害降低了猕猴桃果实的贮藏质量，缩短了贮藏时间[2-3]。其中，猕猴桃采后软腐病主要由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起，是猕猴桃果实采后重要病害之一，给猕猴桃产业造成了严重的经济损失[4]。近年来，人们对农药残留问题的日益关注，促进了化学杀菌剂替代措施的快速完善[5]。据报道，通过非生物和生物因子诱导抗性已成为控制果蔬采后病害的主要研究课题，越来越多的植物诱抗剂已应用于生产中[6]。
AsA-GSH循环作为重要抗氧化系统，可以清除机体的氧化损伤，而抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）是该循环中的关键酶[7]。本课题组近期研究表明，外源茉莉酸甲酯诱导脐橙果实抗青霉病与活性氧代谢密切相关[8]。研究发现，茉莉酸甲酯（MeJA）处理通过调节AsA-GSH循环相关基因表达来提高刺梨果实采后抗病性并保持果实品质[9]。苯丙烷生物合成途径在植物抗逆和抗病害等方面具有重要作用[10]。另有研究表明，6'-O-咖啡酰熊果苷处理通过激活苯丙烷代谢途径增强蓝莓果实对采后灰霉病的抗性[11]。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路可以被各种逆境胁迫信号激活，在植物抗逆信号转导过程中发挥枢纽功能[12]。据报道，MAPK信号可以促进植保素合成以及抑制病菌生长[13]，还可以通过诱导胼胝质的沉积来抵御病原菌入侵，进而增强自身抗性[14]。另外，研究发现胶孢炭疽菌侵染不同抗性葡萄叶片的差异表达基因显著富集在MAPK信号通路，表明该通路可能参与了葡萄抗病的过程[15]。
阿魏酸（ferulic acid，FA）是植物界中广泛存在的一种天然酚酸类物质，常见于谷物、蔬菜和水果的细胞壁中，在植物细胞壁交联、信号分子和植物防御反应中发挥重要作用[16-18]。研究发现，阿魏酸处理可减少桃、黑莓、番茄的采后损失，延缓果实劣变，从而提高贮藏能力[18-20]。另有研究表明，阿魏酸处理显著降低了苹果果实接种青霉菌后的病斑直径和菌落直径，并激活苯丙烷生物合成途径和活性氧代谢途径关键酶的活性和基因表达，促进抗氧化物质和次生代谢产物的合成，从而提高苹果的抗病性[21]。
近年来，FA在植物逆境响应中的积极作用已得到人们的广泛关注[22]。目前，关于FA应用于果蔬采后病害防治及机制探究的研究较少。近年来，转录组技术已广泛应用于果蔬相关研究中，例如梨[23]、苹果[24]等，特别是果蔬采后病害防治领域，其优势在于可以从分子层次深入阐明植物与病原菌之间的互作机制[25-26]。红阳猕猴桃（Actinidia chinensis‘Hongyang’）是我国猕猴桃主要栽培品种之一，目前已经完成了全基因组测序，这为猕猴桃组学研究的开展奠定了良好基础[27]。本研究基于转录组学技术，分析红阳猕猴桃果实应答外源FA和B.dothidea 侵染过程中基因表达情况，以探究FA诱导猕猴桃果实抗采后软腐病的分子机制，为猕猴桃采后病害防治的研究提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料：2024年8月17日采摘江西省奉新县金果家庭农场（28.76° N，115.83° E）的红阳猕猴桃（Actinidia chinensis‘Hongyang’）。当果实可溶性固形物含量（w，下同）为7.0%～7.5%时采收，挑选大小均一、无明显病斑且无机械损伤的果实，当日采摘后于实验室内放置24 h，充分散去田间热，随后用于后续处理。
供试病原菌：葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）由果蔬贮藏与保鲜江西省重点实验室提供。将B.dothidea 在PDA培养基上培养7 d后，用无菌水洗脱孢子，配置成1.0×106 spores·mL-1的孢子悬浮液，现配现用。
实验试剂：阿魏酸（ferulic acid，FA），分析级（CAS：1135-24-6），采购自Solarbio（索莱宝科技有限公司，中国）公司。
1.2 果实处理
将猕猴桃果实随机分为以下4组：（1）接种组，即猕猴桃果实不经FA处理，但接种B.dothidea；（2）FA+接种组，即FA处理后接种B.dothidea；（3）FA处理组，即FA处理，但不接种B.dothidea；（4）对照组，即未经FA处理也未接种B.dothidea。在进行FA处理时，将猕猴桃果实置于0.8 g·L-1 FA溶液中浸泡10 min，对照组则用等量无菌水混合溶液浸泡相同时间。每组处理80个果实，3次生物学重复。在（20±1）℃下，果实静置晾干24 h后，移入超净工作台中通风30 min，随后进行接种。使用75%乙醇对果实表面进行消毒，再使用无菌针刺破果皮，针孔深约2 mm，于伤口处接种30 μL孢子悬浮液（1.0×106 spores·mL-1）。所有接种组果实置于培养箱[（20±1）℃，湿度90%～95%]，用于后续试验。
1.3 病斑大小测量
使用游标卡尺逐日测量病斑直径。每次从接种组和FA+接种组中随机抽取12个果实进行测量，3次重复。诱导效应/%=[（接种组病斑直径—FA+接种组病斑直径）/接种组病斑直径]×100。
1.4 转录组送测样品设置
分别选取第5天接种组、FA+接种组、FA处理组、对照组和第0天空白对照组的猕猴桃果实，每个处理3次重复。将病健交界处的果肉组织经液氮速冻后，于-80 ℃贮存，用于转录组测序，样品分组如表1所示。
表1 样品设置及分组
Table 1 Sample setup and grouping
注：H表示红阳猕猴桃；C表示接种0 d的空白对照；T表示接种葡萄座腔菌；W表示未接种；J表示阿魏酸浸泡处理；K表示清水对照处理；数字表示重复次数。
Note: H represents‘Hongyang’kiwifruit;C represents the blank control inoculated for 0 days;T represents the inoculation of B.dothidea;W represents no inoculation;J represents the ferulic acid immersion treatment;K represents the water control treatment;and the numbers indicate the number of repetitions.
1.5 RNA-seq及数据分析
委托武汉华大基因技术服务有限公司高通量实验室进行样品组织RNA提取及转录组测序。将质控后得到的高质量clean reads比对到猕猴桃基因组数据库（Actinidia chinensis Hongyang v3 Genome；http://kiwifruitgenome.org/）并进行后续分析。将|Log2 Fold Change|≥2，Q-value（adjusted P-value）≤0.05的基因定义为差异表达基因（DEGs），采用FPKM评价基因的表达水平。利用植物转录因子数据库（PlantTFDB）比对基因并进行分类。通过GO数据库（http://geneontology.org）、KEGG数据库（https://www.genome.jp/kegg）对Unigene的序列进行比对，获取注释信息，同时对差异表达基因进行生物通路分类和富集分析。
1.6 qRT-PCR分析
猕猴桃样品组织RNA使用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化，中国）进行提取，RNA浓度使用核酸分析仪（Biochrom Ltd，英国）进行检测，RNA质量使用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检测。cDNA使用反转录试剂盒（翌圣生物，中国）合成。使用TB Green® Premix ExTaq（Takara Bio Inc.，日本）通过qRT-PCR技术检测基因表达水平，参考说明书设置反应程序。选择AcActin（基因ID：Ach05g107181）作为猕猴桃内参基因，利用Primer设计RT-qPCR引物序列（表2）。每个样品设置3次生物学重复。目标基因的相对表达量通过F=2-ΔΔCt公式计算得出。
表2 引物序列
Table 2 Sequences of primers
1.7 数据分析
所有试验至少进行3次重复，数据均以平均值±标准差（s）表示，采用Excel 2019和SPSS 23.0软件进行分析。采用t检验比较两组差异的显著性，采用单因素方差分析（ANOVA）和邓肯多重范围检验评价多组间差异的显著性，P＜0.05为差异显著。使用Origin 2024软件进行相关性分析，采用Pearson进行相关性检验。
2 结果与分析
2.1 FA处理对猕猴桃果实病斑直径的影响
FA处理对猕猴桃果实抗B.dothidea 的影响如图1所示。随着接种时间的延长，病斑直径逐渐增加（图1-A）。接种4 d后，FA+接种组的病斑直径显著小于接种组（图1-B）。0.8 g·L-1 FA处理对猕猴桃软腐病抗性的诱导效应呈先升高后降低的趋势，接种后5 d的诱导效果最好，诱导效应为18.27%，其次是接种后4 d和6 d，分别为15.82%和12.48%（图1-C）。因此，选择诱导效果最好的第5天各组猕猴桃果实组织样本，用于后续的转录组测序分析。
图1 FA对猕猴桃贮藏期间Botryosphaeria dothidea 引起的采后软腐病的影响
Fig.1 The effect of FA on postharvest soft rot disease caused by Botryosphaeria dothidea during the storage of kiwifruit
A.接种Botryosphaeria dothidea 后不同处理组猕猴桃果实的发病症状；B.FA对猕猴桃果实病斑直径的影响；C.FA对猕猴桃抗软腐病的诱导效应。不同小写字母表示在P＜0.05水平显著差异。
A:The disease symptoms of kiwi fruits in different treatment groups after inoculation with Botryosphaeria dothidea;B:The effect of FA on the diameter of disease spots on kiwifruits;C:The induction effect of FA on kiwifruits resistance to soft rot disease.Different lowercase letters indicate significant differences at the P＜0.05 level.
2.2 转录组测序数据质量分析
通过对15个样本进行RNA-seq测序，每个样品获得的clean data平均大小为6.62 GB，数据量满足后续试验分析（表3）。过滤低质量reads后，测序错误率Q30＜0.1%的碱基数占总数的比例均高于91.70%，表明转录组测序质量较好。将检测合格的clean reads与红阳猕猴桃参考基因组（Actinidia chinensis Hongyang v3 Genome）进行对比分析，定位到参考基因组的测序序列的比例范围为85.73%～92.69%，表明选择的猕猴桃基因组合适，且猕猴桃样品无污染。
表3 RNA-seq数据过滤及参考基因组比较
Table 3 RNA-seq data filtering and reference genome comparison
2.3 样本间相关性分析
根据Pearson相关系数，由样本间相关性可知样本间基因表达模式的相似度（图2）。在各分组中，同组内3个重复样本间相关系数均较高（R2=0.92），表明组内样本重复性较好，试验结果可靠，可满足后续分析要求。
图2 样本相关性分析
Fig.2 Sample correlation analysis
2.4 转录因子分析
本研究对编码转录因子（TFs）的基因进行预测分析，并对其所属家族进行分类注释（图3）。结果表明，转录因子家族中数量较多的是bHLH（1643个）、NAC（1218个）、MYB_related（1154个）、ERF（965个）、WRKY（697个）等。上述转录因子具有重要研究价值，与植物生长发育调控、次生代谢产物合成、逆境胁迫应答响应等紧密相关，在果实抗逆调控过程中可能发挥重要作用。
图3 基因所属转录因子家族分类
Fig.3 Classification of transcription factor families
2.5 DEGs数量分析
根据转录组测序数据，将各个样本组间进行两两比较，以|Log2 FC|≥2，Q-value≤0.05为参数，筛选满足条件的差异表达基因（DEGs），结果如图4-A所示。总体而言，转录组共检测到33 402个基因表达。HTJ-vs-HC差异表达基因上调表达5801个，下调5118个；HTK-vs-HC上调5063个，下调4848个；HWJ-vs-HC上调5390个，下调4851个；HWK-vs-HC上调5075个，下调4662个；HTJ-vs-HTK上调500个，下调95个；HTJ-vs-HWJ上调67个，下调87个；HTK-vs-HWK上调292个，下调204个；HWJ-vs-HWK上调622个，下调308个。相较于第0天，第5天各处理组均检测到大量上调或下调表达的DEGs，反映出随着贮藏时间的延长，猕猴桃果实内部发生了剧烈的生理生化变化，并激活了相关基因的表达以应答响应；而在第5天时，相比对照组，接种处理（HTK-vs-HWK）、FA单一处理（HWJ-vs-HWK）以及FA+接种处理（HTJ-vs-HTK）均诱导了大量DEGs显著上调或下调表达，表明了接种B.dothidea 和FA处理均对猕猴桃果实基因转录水平产生了显著影响。
图4 差异表达基因数量统计
Fig.4 Statistics of the number of DEGs
A.差异表达基因数量统计总图；B.（HWJ-vs-HWK）组的差异表达基因散点图；C.（HTJ-vs-HTK）组的差异表达基因散点图。
A.Statistical overview of the number of DEGs;B.Scatter plot of DEGs in (HWJ-vs-HWK) group;C.Scatter plot of DEGs in (HTJ-vs-HTK)group.
其中，重点关注FA单一处理及FA+接种处理的差异表达基因，旨在探讨FA单一处理及FA+接种处理对猕猴桃果实抗性的影响。DEGs差异分布情况如图4-B所示，（HWJ-vs-HWK）组共检测到930个DEGs，（HTJ-vs-HTK）组则为595个DEGs。结果表明，这些DEGs可能在FA诱导果实抗性提高的调控中发挥重要作用，为筛选与维持果实品质和诱导抗病性相关的关键基因提供依据。
2.6 GO分析
以|Log2 FC|≥2，Q-value≤0.05为阈值，将猕猴桃果实（HWJ-vs-HWK）组和（HTJ-vs-HTK）组的DEGs进行GO分类。差异表达基因GO注释分类结果如图5所示，2个处理组的生物过程类目中基因数量最多的依次为细胞过程、代谢过程、对刺激的反应以及生物调节等。细胞组分类目主要包括细胞、细胞器以及膜等，分子功能类目主要包括催化活性、结合及转录调节活性等，表明FA处理对采后猕猴桃贮藏过程中果实代谢与酶的催化功能影响较大。值得注意的是，GO分析还注释到分子功能类目里的抗氧化活性。因此，推测FA可能通过积极的维持正常生命活动和调控相关抗逆、抗氧化响应基因的表达以延缓果实衰老和抵御病害的发生。
图5 差异表达基因GO分类分析
Fig.5 GO classification analysis of DEGs
2.7 KEGG分析
分别对（HWJ-vs-HWK）组和（HTJ-vs-HTK）组的DEGs进行KEGG Pathway富集分析，以P-value≤0.05为参数，Q-value最小的前20个Pathway绘制富集气泡图（图6）。相较于对照，FA单一处理后DEGs富集到以下生物通路：次生代谢物的生物合成、植物-病原体互作、苯丙烷生物合成、亚油酸代谢、类黄酮生物合成、MAPK信号通路-植物、代谢途径、抗坏血酸与醛酸代谢以及谷胱甘肽代谢等，推测这些生物通路可能是参与猕猴桃果实响应FA处理的重要途径。与接种组相比，FA+接种处理后，DEGs主要富集在以下生物通路：谷胱甘肽代谢、植物-病原互作、MAPK信号通路-植物、单萜类生物合成、苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、次生代谢物的生物合成及代谢途径等，推测以上生物通路可能参与响应FA诱导猕猴桃果实抗采后软腐病的调控过程。
图6 差异表达基因KEGG富集分析
Fig.6 KEGG enrichment analysis of DEGs
其中，两个比较组共同的富集通路为代谢途径、次生代谢物的生物合成、植物-病原互作、苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、MAPK信号通路-植物以及谷胱甘肽代谢，主要涉及谷胱甘肽、抗坏血酸等抗氧化相关物质以及木质素、类黄酮等抗性防御相关的次生代谢产物。值得注意的是，AsA-GSH循环和苯丙烷生物合成与植物抗性、抗氧化活性密切相关，而MAPK信号通路也在植物免疫过程中扮演重要角色。基于以上结果，推测抗坏血酸-谷胱甘肽代谢途径、苯丙烷生物合成途径以及MAPK信号通路可能是响应FA诱导的关键途径，而苯丙烷代谢和抗氧化代谢可能在FA诱导猕猴桃果实抵御病原菌侵染和维持自身品质的过程中发挥重要作用。
2.8 FA对抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响
基于RNA-seq数据，对参与猕猴桃谷胱甘肽和抗坏血酸代谢途径的主要DEGs进行筛选与分析，结果如图7所示。与对照相比，FA单一处理后，编码L-抗坏血酸过氧化物酶（APX）、抗坏血酸还原酶（MDHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的基因共有46个，其中上调表达的基因占72%。而FA+接种处理后的基因表达情况与FA单一处理的相比存在差异，上调表达的基因占总数的61%。
图7 HWJ-vs-HWK组和HTJ-vs-HTK组中与抗坏血酸-谷胱甘肽循环相关的差异表达基因（DEGs）的途径分析
Fig.7 Schematic diagram of pathway analysis of DEGs related to AsA-GSH cycle in the(HWJ-vs-HWK)group and the(HTJ-vs-HTK)group
左图为抗坏血酸-谷胱甘肽循环示意图；右图为该途径关键酶所对应的差异表达基因的表达量热图。
The left figure is a schematic diagram of the AsA-GSH cycle;the right figure is a heat map showing the expression levels of DEGs corresponding to the key enzymes in this pathway.
上述结果表明，在FA单一处理或FA+接种处理下，猕猴桃果实在抗坏血酸和谷胱甘肽代谢途径中展现出不同的基因表达模式。FA处理致使猕猴桃果实发生转录重编程，通过调控AsA-GSH循环中关键酶的基因表达，重塑代谢流向，以此协同调节谷胱甘肽、抗坏血酸等抗氧化剂的生成量，使其保持动态平衡，以维持机体活性氧（reactive oxygen species，ROS）稳态，从而达到延缓果实衰老和抵御病原物侵染的最佳状态。
2.9 FA对苯丙烷生物合成途径的影响
基于RNA-seq数据，对参与猕猴桃苯丙烷生物合成途径的主要DEGs进行筛选与分析，结果如图8所示。相较于对照，FA单一处理可诱导编码苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4羟化酶（C4H）和大部分4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）的基因显著上调表达，促进酚类物质的生物合成。随后，香豆素进入类黄酮和木质素合成途径。其中，类黄酮合成途径关键酶的基因表达发生变化：编码查耳酮合酶（CHS）的基因中3个显著上调，1个下调；编码查耳酮异构化酶（CHI）的基因中4个显著上调，2个下调；编码柚皮素3-双加氧酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和黄酮醇合成酶（FLS）的基因均显著上调。在木质素合成途径中，编码香豆酰辅酶A还原酶（CCR）、羟基肉桂酰基转移酶（HCT）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）和肉桂醇脱氢酶（CAD）的基因共有22个，其中上调表达的占55%。
图8 HWJ-vs-HWK组和HTJ-vs-HTK组中与苯丙烷生物合成途径相关的差异表达基因（DEGs）的分析
Fig.8 Schematic diagrams of the analysis of DEGs related to the phenylpropane biosynthesis pathway in the(HWJ-vs-HWK)group and the(HTJ-vs-HTK)group
然而，FA+接种处理后的基因表达情况相比FA单一处理发生了明显变化。FA+接种处理后，编码PAL的3个基因、C4H和4CL均上调表达，总体上与FA单一处理的结果相似，即不论是否接种B.dothidea，FA处理均诱导苯丙烷合成途径上游关键酶基因表达，保证其代谢产物生成总量的稳定。然而，相较于接种组，FA+接种组猕猴桃下游分支类黄酮合成途径中编码F3H、DFR、FLS的基因表达均受到抑制；编码CHS的3个基因表达受到明显抑制，只有1个基因被激活；以及编码CHI的3个基因表达受到明显抑制，3个基因被激活。同时，在木质素合成途径中，编码HCT的4个基因表达均受到抑制；而编码CCR的9个基因、编码CCoAOMT的3个基因以及编码CAD的6个基因中共有61%的基因被激活。值得注意的是，在G-木质素转化为S-木质素的过程中，阿魏酸-5-羟基酶（F5H）和咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）发挥重要作用。在FA单一处理和FA+接种处理后，编码F5H的基因表达均显著下调，而编码COMT的基因表达均显著上调。
综上所述，在FA单一处理或FA+接种处理下，猕猴桃果实在苯丙烷生物合成途径展现出不同的基因表达模式。FA处理致使猕猴桃果实发生转录重编程，通过调控苯丙烷生物合成途径关键酶基因的表达，重塑代谢流向，协同调节酚类、木质素和类黄酮等苯丙烷代谢途径的各次生代谢产物生成量，以综合提高物理防御能力和化学防御能力，从而最大程度地抵御病原物侵染。
2.10 转录因子介导的苯丙烷生物合成分析
在苯丙类代谢途径中，CHS和HCT分别引导代谢通量转化为类黄酮和木质素的生物合成，而F5H和COMT则共同介导木质素途径中G-木质素向S-木质素的转化。上述4个酶在调控苯丙类途径中类黄酮和木质素的生成量及比例方面扮演着关键角色。因此，笔者暂且将编码这些酶的基因称作苯丙烷生物合成途径的“开关基因”，这些基因在FA或接种处理下均显著差异表达（图8），可进一步探究其调控机制。
苯丙烷生物合成途径受多个结构基因和转录因子（TF）调控。在本研究中，笔者鉴定出了多个TF家族，包括bHLH、NAC、ERF、WRKY、MYB等（图3），可能与植物的次生代谢产物合成、逆境胁迫应答响应等密切相关。相关研究发现，WRKY和MYB转录因子可能参与木质素和类黄酮生物合成的协同转录调控[28]。
本研究比较了FA+接种组和接种组中基因表达的变化情况，筛选到显著差异表达的21个WRKY和32个MYB转录因子，并将其与苯丙烷生物合成相关的部分重要结构基因（AcCHS、AcHCT、AcF5H 和AcCOMT）进行相关性分析（图9）。结果表明，多个差异表达的WRKYs和MYBs与苯丙烷生物合成相关的结构基因显著相关（P＜0.05）。其中，与AcCHS呈显著相关的包括WRKY家族的Actinidia20233，Actinidia32602，Actinidia11544，Actinidia12316，Actinidia26895；MYB家族中的Actinidia05555，Actinidia17942，Actinidia21416，Actinidia22374，Actinidia27163，Actinidia27298，Actinidia34109，Actinidia37434等。与AcHCT呈显著相关的包括WRKY家族 的 Actinidia02845，Actinidia12316，Actinidia26895；MYB家族中的Actinidia17942，Actinidia21416，Actinidia22374，Actinidia34109，Actinidia37434 等。与AcF5H 呈显著相关的包括MYB家族的Actinidia17942 和Actinidia37835。与AcCOMT呈显著相关的包括WRKY家族的Actinidia11544；MYB家族的Actinidia05720和Actinidia37434等。
图9 苯丙烷生物合成途径部分关键基因与差异表达的部分转录因子的相关性分析
Fig.9 Correlation analysis of some key genes in the phenylpropane biosynthesis pathway and some differentially expressed TFs
A.苯丙烷生物合成途径部分关键基因与WRKYs的相关性分析；B.苯丙烷生物合成途径部分关键基因与MYBs的相关性分析。
A.Correlation analysis of some key genes of the phenylpropane biosynthesis pathway and WRKYs;B.Correlation analysis of some key genes in the phenylpropane biosynthesis pathway and MYBs.
本研究发现WRKY家族的Actinidia12316、Actinidia26895 和MYB家族的Actinidia17942、Actinidia21416、Actinidia22374、Actinidia34109、Actinidia37434 与AcCHS、AcHCT 结构基因均呈显著相关；MYB家族的Actinidia17942 与AcCHS、AcHCT 和AcF5H 结构基因均呈显著正相关；MYB家族的Actinidia37434与AcCHS、AcHCT和AcCOMT结构基因均显著相关。基于以上分析，本研究推测这些转录因子可能与苯丙烷生物合成途径的结构基因相互作用，进而协同调控类黄酮和木质素合成。
2.11 FA对MAPK信号通路的影响及PPI分析
为了进一步探究FA处理对猕猴桃抗性的影响，基于RNA-seq数据中，对参与猕猴桃MAPK信号通路的主要DEGs进行筛选与分析，如图10-A所示。FA单一处理下，除Actinidia26407 和Actinidia32119下调表达外，其余DEGs均上调表达；而FA+接种处理下，除Actinidia26407 和Actinidia32021 下调表达外，其余DEGs均显著上调表达，且总体上调幅度大于FA单一处理。以上表明在遭受B.dothidea 侵染后，猕猴桃果实产生的应答响应更为强烈，其可能通过调控MAPK信号通路相关基因表达以启动防御反应。
图10 MAPK信号通路的差异聚类分析和差异表达基因（HTJ-vs-HTK）的蛋白质-蛋白质互作网络
Fig.10 Cluster analysis of DEGs in the MAPK signaling pathway and PPI of DEGs(HTJ-vs-HTK)
A.MAPK信号通路的差异聚类分析的热图；B.差异表达基因（HTJ-vs-HTK）的蛋白质-蛋白质互作网络图。每个点代表一个基因，连线表示基因间的互作关系。点的颜色和大小表示互作连接数。颜色由蓝色到红色渐变，颜色越红、点越大，表示互作连接数越多（斥力=800）。
A.Heat map of DEGs clustering analysis of the MAPK signaling pathway;B.PPI of DEGs(HTJ-vs-HTK).Each point represents a gene,and the interactions between genes are represented by connecting lines.The number of interaction connections is indicated by the color and size of the points.The color changes from blue to red,the redder the color and the larger the point,the more interaction connections there are(repulsive force=800).
为了进一步研究FA诱导猕猴桃抗采后软腐病的分子机制，挖掘相关调控网络及关键通路，本研究基于FA+接种处理的DEGs数据，构建了用于预测的蛋白质-蛋白质互作网络（PPI），结果如图10-B所示。互作节点数最大、调控基因数量最多的是Actinidia03761，与其相互作用的差异表达基因为15个，注释为丝裂原活化蛋白激酶MPK3。而Actinidia03761 恰好也是MAPK信号通路上主要的差异表达基因。PPI结果显示Actinidia03761处于蛋白互作网络的核心，表明其可能是FA诱导猕猴桃抗采后软腐病调控网络的枢纽。而且Actinidia03761在FA单一处理和FA+接种处理后均显著上调表达（图10-A），表明该基因可能在FA诱导猕猴桃抗采后软腐病中发挥正向促进作用。综上所述，MAPK信号通路中的差异表达基因Actinidia03761（AcMPK3）是FA诱导猕猴桃抗采后软腐病调控网络中的关键核心基因。
2.12 转录组数据验证
为了验证RNA-seq数据的准确性和可重复性，本研究采用了RT-qPCR方法，随机选取了谷胱甘肽代谢途径和苯丙烷生物合成途径的7个差异表达关键基因，其具有较高的表达水平，分别是AcGST（Actinidia32509）、AcCOMT（Actinidia18683）、AcHCT（Actinidia18256）、AcCHS（Actinidia11396）、AcCHI（Actinidia29030）、AcF5H（Actinidia11769）、AcCCR（Actinidia18245）。结果如图11所示，qRT-PCR与RNA-seq之间的相关系数R2=0.934 9，表明qRT-PCR与RNA-seq结果一致。
图11 RNA-seq与RT-qPCR结果的线性关系
Fig.11 The linear relationship of RT-qPCR and RNA-seq
Log2 Fold Change(RT-qPCR)
3 讨论
在果蔬采后病害防控中，筛选安全环保的天然诱抗剂正受到人们越来越多的关注。本课题组在前期研究中发现，相较对照组，经过MeJA处理的猕猴桃果实的病斑直径更小，诱导效果更好[29]。研究发现，阿魏酸浸泡苹果后，能够缩小其蓝霉病的病斑直径[21]。而本次试验也证实，阿魏酸处理可以缩小B.dothidea 的病斑直径，提高诱导效果，从而抑制猕猴桃采后软腐病的发生。
当植物受到外界逆境胁迫时，通常会激活自身免疫系统，调节基因表达模式以减轻损伤。研究表明，外源阿魏酸处理可以激活活性氧代谢和苯丙烷途径关键酶活性和基因表达，促进抗氧化剂和次生代谢产物的合成，从而提高苹果抗病性，并维持其贮藏品质[21]。本研究利用转录组技术在猕猴桃果实上得出了相似结论：在FA单一处理和FA+接种处理下，DEGs均富集在植物-病原互作、抗坏血酸与醛酸代谢、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成以及MAPK信号通路等次生代谢和抗病相关途径，表明FA可以通过诱导猕猴桃产生免疫反应、激活MAPK信号通路，以及调节抗坏血酸和醛酸代谢、谷胱甘肽代谢和苯丙烷生物合成代谢等次生代谢相关途径基因表达和代谢物含量以抵御B.dothidea 对猕猴桃果实的胁迫。这一结论与本课题组前期采用MeJA处理猕猴桃得到的试验结果相似[30]。
猕猴桃在贮藏过程中容易受到氧化应激的影响，产生各种ROS[31]。大量的活性氧积累改变了膜组织，引起或加剧脂质过氧化，导致细胞系统受损。为了防止氧化损伤和维持活性氧的稳态，植物进化出一个复杂的抗氧化系统，包括酶和非酶抗氧化成分。过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）是主要的抗氧化酶，而AsA和GSH是主要的非酶促抗氧化剂。AsA-GSH cycle主要由APX、DHAR、MDHAR、GR共同组成，在消除活性氧和防止氧化损伤中发挥关键作用[32]。其中，AsA是一种小分子抗氧化剂，可以与自由基和H2O2相互作用，作为对抗ROS的主要防御机制[33]，在维持采后果实的生理和代谢稳态方面发挥至关重要的作用[34]。本研究发现，FA处理激活了大部分APX、MDHAR和DHAR等抗坏血酸代谢途径相关酶的基因表达，从而维持抗坏血酸含量。而GSH作为一种天然存在于植物中的非酶促活性氧清除剂[35]，在调控ROS水平和赋予氧化抗性方面发挥重要作用[36]。FA处理对谷胱甘肽代谢途径产生明显影响，致使GR、GPX以及GST编码基因的表达水平发生不同程度的变化。通过转录组分析发现，采后Me-JA通过调节AsA-GSH循环来维持谷胱甘肽和抗坏血酸的稳定性[37]。而本研究表明，FA可以通过调节AsA-GSH循环来保持猕猴桃果实中AsA/GSH的动态平衡，维持机体ROS稳态。
苯丙烷生物合成途径是植物中一个重要的次生代谢途径，在植物抗病性中发挥重要作用。从机制上分析，苯丙烷生物合成途径参与植物抗病免疫，因为其代谢合成的木质素，增加了细胞壁厚度，形成了物理屏障以抵御病原菌侵入；另外，苯丙烷生物合成途径产生的多种代谢产物，如酚类和黄酮类等，进一步合成植保素，可以抑制病原菌的生长[38]。苯丙烷生物合成途径包含PAL、C4H和4CL等关键酶，可以催化一系列反应以产生具有抗菌作用的物质，如酚酸、类黄酮和木质素[39]。据报道，肉桂酸的应用可能改变苯丙烷生物合成途径相关基因的表达谱[40]。在本研究中，FA处理改变了苯丙烷生物合成途径，包括类黄酮合成途径和木质素合成途径相关基因表达水平。其中，PAL是苯丙烷生物合成代谢的门户酶，调控从核心代谢（莽草酸途径）到一般苯丙烷生物合成途径的代谢通量[41]。FA处理激活了苯丙烷生物合成途径上游3个关键酶基因（AcPAL、AcC4H 和AcC4L）的表达，促使流向该途径下游的代谢通量总量持续增加。类黄酮是植物体内清除ROS的重要抗氧化剂，也是抵御病原体侵染的必需化学物质[42]。笔者研究发现，FA处理改变了类黄酮合成途径相关酶编码基因（包括CHS、CHI、F3H、DFR和FLS等）的表达水平，进而影响类黄酮化合物的生成。在植物抗病反应中，木质素合成发挥着至关重要的作用。病原侵染后，植物细胞壁的木质素化程度增强，提高了细胞壁的机械强度，增强了对病原分泌的细胞壁降解酶的抵抗力[42]。本研究同样发现，FA处理改变了木质素合成途径中HCT、CCR、CCoAOMT、F5H、COMT和CAD编码基因的表达水平，进而影响木质素的合成。
木质素与类黄酮物质的合成均源自苯丙氨酸代谢途径，二者之间既相互联系又相互竞争。近期研究表明，维持木质素和类黄酮生物合成途径之间的代谢平衡有助于协调植株抗性和果实品质之间的平衡[43]。而HCT和CHS是调控底物香豆酰辅酶A（p-Coumaroyl-CoA）进入木质素生物合成途径或类黄酮生物合成途径的关键酶，影响着木质素和类黄酮的代谢平衡[44]。笔者研究发现，FA处理通过上调或下调AcHCT和AcCHS基因表达，改变苯丙烷生物合成途径的碳分流，从而精密调控木质素和类黄酮的生成量及比例。此外，研究表明S/G木质素比率会影响生物抗逆性和对植物病害的抗性[45]，而F5H和COMT调控G-木质素向S-木质素的转化。在FA单一处理和FA+接种处理下，AcF5H 的基因均显著下调表达，AcCOMT 基因均显著上调表达，表明FA可能通过综合调控AcF5H和AcCOMT的基因表达，以改变S/G木质素比率，进而影响猕猴桃果实对采后病害的抗性。
转录因子通过与顺式作用元件特异性结合，进而参与细胞各类生命活动。本研究通过对转录因子进行分析，筛选出可能调控DEGs表达的WRKY和MYB家族转录因子，这两类家族转录因子已被证实与苯丙烷生物合成途径中多个结构基因的调控相关[28]。研究发现，WRKY家族成员正向调控苯丙烷生物合成途径相关基因的表达，从而增强百合对灰霉病的抗性[46]。生物胁迫等环境因子通过激活木质素特异性MYB转录因子诱导木质素沉积，并引起黄酮类化合物的积累[41]。一些R2R3-MYB转录因子通过调节木质素或类黄酮合成，将碳流重新定向至类黄酮或木质素合成途径，从而维持植物中木质素和类黄酮之间的碳流平衡。如菊花CmMYB1 和CmMYB8通过调控HCT、F5H、COMT等关键基因的表达来调节木质素合成，并通过调控CHS、CHI、DFR等基因表达来调节类黄酮合成[28]。基于RNAseq数据，笔者将苯丙烷生物合成途径中决定木质素和类黄酮生成比例及S/G木质素生成比例的4个“开关基因”（AcHCT、AcCHS、AcF5H和AcCOMT）的表达水平，与FA+接种处理后WRKY家族和MYB家族DEGs的表达水平进行相关性分析。结果表明，多个差异表达的WRKYs和MYBs与上述“开关基因”呈显著相关（P＜0.05）。此外，笔者发现WRKY家族中的Actinidia12316、Actinidia26895 和MYB家族中的Actinidia17942、Actinidia21416、Actinidia22374、Actinidia34109、Actinidia37434 与AcCHS、AcHCT 结构基因均呈显著相关；MYB家族中的Actinidia17942 与AcCHS、AcHCT 和AcF5H 结构基因均呈显著正相关；MYB家族中的Actinidia37434 与AcCHS、AcHCT 和AcCOMT 结构基因均呈显著相关。这些转录因子可能同时通过与多个苯丙烷生物合成途径的“开关基因”相互作用，进而调节类黄酮和木质素之间的平衡。以上结果表明，FA可能通过介导转录因子靶向调控苯丙烷生物合成途径的关键结构基因或调控因子，从而实现转录调控。
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导能够将胞外刺激转入胞内，从而引起一系列逆境胁迫生理响应[47]。前人研究发现，MAPK信号通路被激活后，可促使WRKY33被激活，从而诱导植保素合成，增强对灰霉病的抗性[48]。本研究发现，FA单一处理和FA+接种处理下，MAPK信号通路的大部分DEGs基因均显著上调表达，且后者的上调程度更大，这可能与植物的敏化反应抗性有关。敏化反应抗性是一种基于代谢平衡和防卫反应的植物抗性模式，仅在植物遭受严重生物胁迫时才进行表达，可显著减少植物的适应度损失[49]。外源物质除了直接诱导果实抗性外，还可能通过敏化反应促使果实在遭受病原菌侵染后能够更快地启动防卫反应。例如，经低浓度茉莉酸甲酯、β-氨基丁酸或褪黑素处理后，激活了敏化反应，使果实在接种病原菌后快速激活抗病相关基因表达，促进植保素合成，增强果实的抗病能力[49-51]。本研究表明，与FA单一处理相比，FA+接种处理对猕猴桃果实MAPK信号通路的激活程度更大，表明猕猴桃果实在遭受B.dothidea侵染后，果实对FA产生强烈的应答响应，其可能通过调控MAPK信号通路以启动防御反应，从而激活下游抗病相关基因的表达，促进植保素积累，增强果实抗性。此外，MPK3在拟南芥的防御反应中扮演着重要角色，参与了MKP1-MAPK级联反应，通过调控MYB4转录因子来调节木质素生物合成以增强抗性[52]。而且，MPK3可磷酸化转录因子ERF6，持续激活防御相关基因，从而增强拟南芥对灰霉病等真菌病原菌的抗性[53]。本研究借助PPI分析了FA+接种组与接种组的DEGs，发现猕猴桃MAPK信号通路中的差异表达基因Actinidia03761（AcMPK3）是蛋白互作网络的核心，表明其可能是FA诱导猕猴桃抗采后软腐病调控网络的关键枢纽。
上述基因为FA诱导猕猴桃抗病作用机制的研究提供了潜在靶点。然而，猕猴桃果实对FA的响应是一个复杂的精密调控过程，FA如何串联猕猴桃抗病分子调控网络，又是如何具体协调各个生物通路以发挥防御作用，仍有待进一步地研究。
4 结论
FA可能通过精密调控AsA-GSH循环、苯丙烷生物合成以及MAPK信号通路，诱导猕猴桃果实增强对采后软腐病的抗性。研究结果为揭示FA诱导的植物抗病机制提供了新见解。综上所述，阿魏酸可作为一种极具开发潜力的天然诱抗剂，在果蔬采后病害防治中具有广泛的应用前景。
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