果胶是植物细胞壁的主要成分之一，在维持细胞壁完整性、调控植物生长发育和抗逆反应中发挥重要作用[1]。细胞壁果胶在高尔基体中合成后呈现高度甲酯化状态，而果胶甲酯酶（pectin methyl esterase，PME，EC 3.1.1.11）作为果胶水解代谢过程中的关键酶，通过调控果胶的去甲酯化水平影响其结构和细胞特性[2-4]。
PME属于碳水化合物酯酶CE8家族，最早发现于胡萝卜（Daucus carota）中[2]，该基因的全基因组鉴定已在许多物种中得到广泛研究，如在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、桃（Prunus persica）、梨（Pyrus bretschneideri）中分别鉴定出66、79、69、81个PME基因家族成员[5-8]。PME通常是以pre-pro-protein的形式存在，主要由PRE结构域、PRO结构域和PME结构域等三部分构成[9]。其中，PRE结构域为N端信号肽区域，主要负责引导蛋白跨膜转运与定位，是蛋白成熟加工前的关键序列[1，7]。根据PRO结构域的存在与否，PME基因家族可分为两类。Type-Ⅰ仅含有催化活性区PME结构域（PF01095）；Type-Ⅱ除含有PME结构域外，在N端还含有PRE结构域与PRO结构域。PRO结构域与果胶甲酯酶抑制子（pectin methyl esterase inhibit，PMEI）结构域（PF04043）具有相似性，PRO结构域可能作为分子内抑制子抑制PME活性，避免PME过早发挥去甲酯化作用[3，10-11]。PMEs在调节植物生长发育、激素信号传导及对各种生物及非生物胁迫的响应中发挥重要作用[2]。在模式植物拟南芥中，AtPME2[12]、AtPME3[13]、AtPME5[14]、AtPME35[15]以 及AtPME58[16]参与植物不定根形成、细胞壁硬化、形态建成、种子萌发等多种生长发育过程；AtPME17[17]、AtPME31[18]、AtPME34[19]和AtPME41/48[20-21]分别响应灰霉病、盐胁迫、热胁迫、低温胁迫。此外，PMEs在调节果实品质方面也发挥重要作用，如杏PaPME1[22]、草莓FvPME38/39[23]影响果实硬度；脐橙CsPME3为低温诱导汁胞粒化的关键因子[24]；番茄PME酶活性影响果实中可溶性糖和可溶性固形物含量[25]；苹果MdPME2参与调控果肉粉质化性状[26]，MdPME3为调控果皮脆度的关键基因[27]。目前，关于果实中果胶甲酯化修饰的研究尚处于起步阶段[28]。对PME基因的研究主要集中于采后贮藏方面，而其在果实发育过程中的作用则鲜有报道[29]。
苹果（Malus domestica）是中国重要水果之一，其产量和种植面积均居世界领先水平[32]。本研究对苹果PME基因家族成员进行全基因组分析，包括理化性质、系统发育树、基因结构、染色体分布、基因复制事件等，通过转录组数据和qRT-PCR分析PME基因在苹果果实发育过程中的表达模式，旨在全面系统地解析苹果PME基因进化和功能的信息，以期为今后深入研究PME基因功能研究提供一定的理论基础。
1 材料和方法
1.1 PME基因家族鉴定
通过蔷薇科基因组数据库GDR（https://www.rosaceae.org/）下载苹果参考基因组数据（GDDH13 Version 1.1）。通过TAIR网站（https://www.arabidopsis.org/）获得66个拟南芥PME成员蛋白序列，并以此作为查询序列，使用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists）v2.097软件通过BLAST在苹果基因组中进行搜索（E＜1e-5），将搜索到的苹果蛋白序列与在线网 站uniprot（https://www.uniprot.org/）中 的Swissprot数据库进行Blast匹配，获得候选基因家族成员；另外，通过Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）获得PME蛋白保守结构域HMM文件PME domain（PF01095）和PMEI domain（PF04043），使用TBtools-Ⅱ通过HMM搜索苹果蛋白数据库[30-31]。将通过两种方法共同获得的苹果PME蛋白作为候选基因，利用NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和 SMART（https://smart.embl.de）在线工具分析PME基因的基因结构和保守结构域。根据苹果基因组gff3注释文件，利用TBtools-Ⅱ软件中Gene Structure View（Advanced）进行可视化，包括外显子和内含子的数量及长度[32]。
1.2 PME基因进化分析
使用MEGA-X软件中的MUSCLE对苹果、拟南芥、梨和番茄共157个PME蛋白的全长序列进行氨基酸序列比对[33]，并采用最大似然法（ML）构建系统发育树，Bootstrap 1000次重复。
1.3 PME基因蛋白理化性质及亚细胞定位预测
使用TBtools-Ⅱ软件中Protein Paramter Calc对苹果PME基因家族成员理化性质（包括氨基酸数、相对分子质量、理论等电点pI、不稳定性指数、脂肪族指数和亲疏水性）进行分析。MdPMEs蛋白的二级结构利用在线网站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）进行预测。亚细胞定位通过在线网站Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行预测与分析[34]。
1.4 PME基因染色体定位和共线性分析
使用TBtools-Ⅱ软件中Gene Location Visualize from GTF/GFF对苹果PME基因在染色体上的位置信息进行可视化[35]。通过TBtools-Ⅱ软件中OneStep MCScanX分析苹果PME基因物种内的共线性关系[32]。
1.5 MdPMEs启动子元件分析
为了研究苹果PME 基因家族成员启动子区域，从苹果基因组数据中提取翻译起始点上游的2000 bp区域，并使用Plant-CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库对启动子中的顺式作用元件进行鉴定，使用TBtools-Ⅱ对分析结果进行可视化[36]。
1.6 基于转录组数据的MdPMEs表达模式分析
以蜜脆苹果为试材，采样点为中国农业科学院果树研究所。采样时期为幼果期（花后40 d）、膨大期（花后100 d）、成熟期（花后130 d）和采后4 ℃贮藏60 d（贮藏期间不做任何保鲜处理）4个时期，每个时期设置3次生物学重复。RNA-seq由基迪奥生物科技有限公司（https://www.genedenovo.com）通过Illumina HiSeq 2500高通量测序平台完成，基于FPKM值，采用log法均一化处理数据，利用TBtools软件绘制聚类热图。
选择4个不同发育时期的蜜脆苹果果肉进行PME 基因的表达验证。RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司，cDNA第一条链合成所采用的反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。MdPMEs 荧光定量引物如表1所示，选用MdActin（EB136338）作为内参基因。反应体系为2×UltraSYBR Mixture（Low ROX）5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，cDNA 0.5 μL，总体积10 μL。反应条件为95 ℃10 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，40个循环。采用△Ct方法计算基因的相对表达量，每次试验进行3次生物学重复。
表1 实时荧光定量PCR所用引物序列
Table 1 Primers used for qRT-PCR
1.7 MdPMEs互作蛋白的预测
利用STRING（https://string-db.org/）网站，以拟南芥相应的同源蛋白作为参考，对候选蛋白MdPME13、MdPME15、MdPME40、MdPME42、MdPME46和MdPME79进行互作蛋白预测分析。
1.8 数据分析
基因表达数据均以平均值±标准误表示。采用Graphpad Prism（9.5版本）软件进行单因素方差分析，使用Excel软件处理数据和作图。
2 结果与分析
2.1 MdPMEs家族基因全基因组鉴定及特征分析
通过BLAST和HMM两种方法鉴定到82个苹果PME 基因，其中30个仅含有PME结构域（PF01095），其余52个同时在N端含有果胶甲酯酶抑制子（PMEI）结构域（PF04043）。
通过对已筛选的苹果PME 基因家族成员进行蛋白序列分析（表2），结果表明，MdPMEs 基因家族成员蛋白序列长度为156～731 aa，蛋白相对分子质量为17.66（MdPME44）～82.23（MdPME58）kDa；pI为5.02（MdPME15）～9.79（MdPME50），平均值为8.01，表明大多数MdPMEs是碱性蛋白；不稳定指数大于40的MdPMEs占比7.32%，表明大部分蛋白稳定性较好；亲水性系数为-0.52（MdPME68）～0.10（MdPME9），其中95.12%的蛋白亲水性系数为负值，表明大多数蛋白是亲水性的；脂溶性系数为60.06（MdPME49）～102.59（MdPME9）；亚细胞定位预测分析显示苹果PME 基因家族成员均定位于细胞壁上，这与其调控果胶去甲酯化的功能相吻合。
表2 苹果PME 基因家族成员理化性质分析及亚细胞定位预测
Table 2 Analysis of physicochemical properties and prediction of subcellular localization of apple PME gene family members
表2 （续）Table 2 (Continued)
为进一步明确MdPMEs蛋白的空间结构，分别对82个MdPMEs蛋白的二级结构进行预测，分析了其α螺旋、延伸链和无规则卷曲所占比例。其中，α-螺旋所占比例14.24%～39.12%；延伸链所占比例12.59%～30.81%；无规则卷曲所占比例最大，为40.90%～63.46%（表3）。整体来看，MdPMEs蛋白二级结构以无规则卷曲为主要构象，α-螺旋与延伸链占比相对较低。
表3 MdPMEs蛋白的二级结构
Table 3 Secondary structure of MdPMEs protein
2.2 MdPMEs家族成员结构分析
为鉴定MdPMEs 结构特征在进化中的保守性，利用TBtools-Ⅱ软件对MdPMEs家族成员基因结构进行分析，并对蛋白序列含有的motif和domain及外显子-内含子的相对位置进行可视化展示（图1）。结果表明，相似的外显子-内含子结构的基因倾向于聚集在相同的亚群中，筛选到的82个MdPMEs基因家族成员明显被分为Group 1、Group 2、Group 3、Group 4。Group 1亚家族成员最多（41个），含有2～3个外显子，其中MdPME14缺乏内含子；Group 2亚家族有12个成员，大多含有2～3个外显子，其中MdPME82 缺乏内含子；Group 3亚家族有25个成员，外显子-内含子数量最多，其中76%的基因含有4～6个外显子和3～5个内含子，MdPME43 含有8个外显子，MdPME59和MdPME66缺乏内含子；Group 4亚家族成员最少（4个），均含有2个外显子。多数MdPMEs基因家族成员的外显子长度大于内含子。
图1 苹果PME 基因结构和保守结构域
Fig.1 Structure and conserved domain of PME genes in apple
图中从左到右代表的依次为MdPMEs基因进化树（节点上的数字代表分枝的可信度，不同颜色代表不同亚家族）、保守基序、基因结构。
From left to right,the MdPMEs gene phylogenetic tree(the number on the node represents the reliability of the branch,and different colours represent different subfamilies),conserved motifs,gene structure are shown from left to right.
为研究苹果PME蛋白的保守结构域，利用在线软件MEME鉴定了MdPMEs蛋白序列中10个保守的Motif（图2），将其命名为Motif1～Moitf10。每个保守基序的长度为15～38个氨基酸（Motif8、Motif1）。在MdPMEs 基因家族成员中，含有Motif1基序的成员最多，为79个；含有Motif10基序的成员最少，为47个。不同亚族中PME蛋白序列包含的保守基序种类及数量存在差异，同一亚族分支的蛋白序列呈现相似的保守基序排列方式。Group 1和Group 2亚家族多数成员含有10个Motif，且多数家族成员N端含有Motif10，Motif排序大致为Motif7、Motif8、Motif9、Motif6、Motif3、Motif1、Motif4、Motif2、Motif5、Motif10，其中仅MdPME14和MdPME49含有4个Motif。Group 3和Group 4家族成员N端不含Motif10，且多数成员含有8～9个Motif，其中MdPME44 仅含有Motif2。以上结果表明，MdPMEs成员Motif分布数量和位置基本一致，其结构域和功能单位具有较高的相似性，在进化过程中具有较高的保守性。
图2 苹果PME 基因保守基序序列信息
Fig.2 Conserved motif sequence information of PME genes in apple
2.3 MdPMEs家族成员染色体分布及共线性分析
为明确苹果PME基因在染色体上的分布，基于苹果基因组信息，将鉴定到的MdPMEs 家族成员定位到15条染色体上（图3）。结果表明，84个MdPMEs 基因在染色体上呈现不均匀分布，其中2号染色体上分布的MdPMEs 成员最多，为15个；7号、15号染色体上均分布着8个MdPMEs 基因；5号、6号染色体上仅分布1个，分别为MdPME31 和MdPME32。此外，部分MdPMEs 基因在染色体上紧密排列，存在明显的串联重复现象，如2号染色体上同一位置集中分布着MdPME9、MdPME10、MdPME11、MdPME12、MdPME13和MdPME14。
图3 苹果PME 基因染色体定位
Fig.3 Chromosomal locations of PME genes in apple
为阐明苹果PME 基因家族成员在基因组进化过程中的扩增机制，通过TBtools-ⅡMCScan X对筛选出的82个苹果MdPMEs 基因进行了种内共线性分析（图4）。在MdPMEs基因家族成员中发现了30对共线性基因，形成了全基因组复制对，表明苹果PME基因在进化过程中发生了基因复制，部分基因的功能可能存在相似性。对复制事件进行统计发现，共有44个基因发生了全基因组重复（whole-genome duplications，WGD），占总重复事件的比例最高，为53.66%；分别有16个基因发生了串联重复（tandem duplication）和分散重复（dispersed duplication），占总重复事件的19.51%；6个基因发生了近端重复（proximal duplication），占总重复事件的比例最低为7.32%（表4）。以上结果表明，全基因组重复可能是苹果PME基因家族扩张的主要原因。
图4 苹果PME 基因种内共线性分析
Fig.4 Intraspecific synteny analysis of PME gene in apple
灰色线条代表苹果所有存在共线性的基因对，彩色线条代表MdPMEs 基因的共线性基因对，红色标注的为发生串联重复的基因。
The grey lines represent all collinearity gene pairs in apple,while the coloured lines represent those specific to MdPMEs genes,and the red lines are the genes with tandem repeats.
表4 MdPMEs 基因进化关系类型
Table 4 The type of evolutionary relationships of MdPME genes
2.4 MdPMEs家族成员启动子分析
为研究PME 基因潜在的调控作用机制，本研究使用在线分析软件PlantCARE对MdPMEs基因转录起始点上游2000 bp启动子序列的顺式作用元件进行预测。结果表明，除了CAAT-box和TATA-box等真核生物基本启动子元件外，共预测了17种与植物生长发育、激素信号传导和逆境胁迫响应相关的顺式作用元件（图5）。光响应元件最多，占总顺式作用元件的45.24%；其次是激素调控相关的响应元件，包括茉莉酸甲酯、赤霉素、脱落酸、水杨酸、生长素响应元件；逆境相关元件包括低温、应激和防御、厌氧诱导、干旱诱导、损伤响应元件。
图5 苹果PME 基因启动子序列cis 元件分析
Fig.5 Cis elements analysis of the promoters of PME genes in apple
此外，本研究还预测到多种与植物生长发育相关的顺式作用元件，包括参与胚乳表达和分生组织表达相关的响应元件，表明PME基因可能参与种子萌发和细胞分裂过程。还有一些与生理节奏调控、类黄酮生物合成基因调控、栅栏叶肉细胞分化、玉米醇溶蛋白代谢调控和细胞周期调控相关的响应元件。综上表明，MdPMEs 基因家族成员可能参与多种植物生长发育过程，并响应非生物胁迫与多种植物激素应答。
2.5 MdPMEs家族成员系统发育树分析
为了分析苹果和其他物种PME 之间的进化关系，本研究利用鉴定的82个MdPMEs，与拟南芥、番茄、和梨等物种PME 基因氨基酸序列构建系统进化树（图6）。基于拟南芥基因家族分类，MdPMEs蛋白可分为4类（Group 1～Group 4），该分类与上述（图1）分类结果基本一致。不同物种中相似度较高的序列通常发挥着相似作用，表明该家族成员在不同物种间具有较高的保守性。
图6 苹果与其他物种PME 基因家族的系统进化树构建
Fig.6 The phylogenetic tree construction of PME gene family in apple and others
2.6 MdPMEs 基因在果实发育过程中的表达模式分析
通过对蜜脆苹果果肉4个不同发育时期的转录组数据进行分析，共筛选出16个在该过程中表达的PME 基因（图7）。这些基因在Group 1～Group 4亚家族中均有分布，其中Group 1亚家族成员最多，占比超过1/2。依据PME基因在果实中的表达丰度进行聚类分析，具有相同或相似表达模式的基因被聚为一类。8个基因在果实整个发育过程中的表达丰度显著高于其他基因，包括MdPME40、MdPME46、MdPME5、MdPME70、MdPME18、MdPME47、MdPME79 和MdPME80，整体上在幼果期到成熟期高表达，果实贮藏后表达丰度下降，其中MdPME40和MdPME46 是果实发育过程表达丰度最高的2个基因；MdPME13 和MdPME15 在果实发育过程中表达丰度先升高后降低，在果实成熟期高表达；其余6个基因在果实整个发育过程中表达丰度相对较低，且整体呈下降趋势。其中，MdPME42在果实低温贮藏后上调表达。
图7 PME 基因在蜜脆苹果果实不同发育时期的表达热图
Fig.7 The expression heat map of PME family genes at different developmental stages in Honeycrisp apples
M1～M4分别代表幼果期、膨大期、成熟期和贮藏期果实。柱子颜色代表目标基因在样本中表达丰度，颜色越红丰度越高，颜色越蓝丰度越低。
M1-M4 represent the young fruit period,enlargement period,mature period and storage period,respectively.The colour of the column represents the expression abundance of the target gene in the sample.A redder colour indicates a higher abundance,whereas a bluer colour indicates a lower abundance.
进一步的qRT-PCR分析结果与转录组数据基本一致，其中MdPME40、MdPME46 和MdPME79在蜜脆果实整个发育阶段相对表达量较高，而MdPME13 和MdPME15 在果实发育前期表达量较低，在成熟期表达量显著升高；MdPME42 在果实贮藏期显著上调表达（图8）。该结果表明MdPME40、MdPME46 和MdPME79 可能在苹果果实整个发育过程中发挥重要作用，MdPME13、MdPME15 和MdPME42 可作为调控果实成熟及贮藏期相关品质的关键候选基因。
图8 PME 基因在蜜脆苹果果实不同发育时期的相对表达量
Fig.8 The relative expression of PME family genes at different developmental stages in Honeycrisp apples
2.7 MdPMEs蛋白的PPI蛋白互作网络分析
为探究MdPMEs 基因的互作蛋白及潜在功能，基于模式植物拟南芥中的同源序列，构建了6个候选MdPMEs蛋白的相互作用关系网络（图9）。结果显示，MdPME13与AtPME32（AT3G43270）同源，MdPME15与AtPME29（AT3G24130）同源，MdPME40与AtPME61（AT5G53370）同 源，MdPME42与 AtPME20（AT2G47550）同 源，MdPME46与 AtPME3（AT3G14310）同 源，MdPME79与AtPME31（AT3G29090）同源。与拟南芥PME蛋白紧密关联的蛋白主要包括三类：第一类为果胶裂解酶，包括K19E20.1（推测为果胶裂解酶20，AT5G48900）、T15N1.140（果胶裂解酶类蛋白，AT5G14650）、F17A9.16（推测为果胶裂解酶8，AT3G07010）、MYH19.70（果胶裂解酶类蛋白，AT5G39910）、F11F8_12（果胶裂解酶，AT3G09540）、B3LF89_ARATH（果胶裂解酶，AT3G55140）、MKP11.14（果胶裂解酶类蛋白，AT5G17200）、PMR6（推测为果胶裂解酶13，AT3G54920）和T4D2.120（推测为果胶裂解酶12，AT3G53190）；第二类为甲基转移酶F18O22.220（推测为甲基转移酶PMT9，AT5G14430）；第三类为聚半乳糖醛酸酶MSJ11.12（推测为聚半乳糖醛酸酶，AT3G15720）和F18O19.3（推测为聚半乳糖醛酸酶，AT2G43860）等。以上结果说明这些互作蛋白与候选PME蛋白在功能上的协同性，可能共同参与果胶的修饰或降解过程。
图9 参考拟南芥PME蛋白构建的MdPMEs蛋白相互作用网络
Fig.9 Protein interaction network of MdPMEs constructed by referring to AtPMEs
圆形节点代表蛋白，其中标注“MdPME”的节点为苹果PME家族蛋白，其余为拟南芥中与PME存在互作的同源蛋白；节点间连线代表蛋白间的互作关系。
Circular nodes represent proteins,among which nodes labeled“MdPME”are apple PME family proteins,and the rest are homologous proteins that interact with PME in Arabidopsis thaliana.Lines between nodes represent protein-protein interactions.
3 讨论
PME是重要的果胶修饰酶之一，广泛参与植物生长发育及生物、非生物胁迫应答，调控种子萌发、果实成熟等多个关键生理过程。PME 基因的相关特征和生物学功能已在模式作物中得到了广泛研究，而苹果作为世界温带地区栽培面积最大的果树之一，有关PME基因功能及家族分析的研究相对较少。因此，对苹果PME 基因进行全基因组分析，并研究其在果实发育中的作用尤为重要[37]。
本研究基于高质量的双单倍体金冠基因组（GDDH13 v 1.1）[38]，在苹果中鉴定出82个PME 基因，该数量与拟南芥[7]、番茄[6]、梨[8]等物种中鉴定到的PME基因家族成员数量相近，表明该基因家族在进化过程中未发生大幅度扩增；基于苹果基因组基因结构的注释，MdPMEs基因在15条染色体上不均匀分布，2、7和15号染色体上的MdPMEs 基因数量占总数的1/3以上。类似结果也在其他物种中得到验证[8，23]，表明这3条染色体上存在MdPMEs基因的进化热点区域。苹果PME蛋白的保守结构域分析显示，同一进化分支的基因具有相似的保守基序及分布，苹果PME家族成员均含有5个典型保守结构域Motif8（GxYxE）、Motif3（QAVAxR）、Motif1（QDTL）、Motif1（GxxDFIFG）、Motif2（YLGRxWx），这与此前拟南芥和桃中报道的研究结果一致[5，7]。此外，大多数家族成员N端含有Motif10，其可能作为果胶甲酯酶抑制子（pectin methyl esterase inhibit，PMEI）结构域（PF04043）发挥作用[3，10-11]，即PRO区域可能含有该段保守基序。进化树分析结果显示，MdPMEs 家族基因可分为4个亚家族，与拟南芥和梨中的分类一致[4，8]，进一步验证了该家族在进化历程中的功能保守性。结合共线性分析发现，WGD可能是苹果PME基因家族扩张的主要驱动力[5，23]。
启动子顺式作用元件分析揭示了MdPMEs 是响应复杂环境信号的分子基础。通过分析MdPMEs 基因上游2000 bp启动子区的顺式作用元件，发现该基因启动子含有大量与激素及非生物胁迫相关的顺式作用元件。其中，与光响应相关的元件数量最多，表明MdPMEs 与植物光响应密切相关；同时，也包括低温响应元件、厌氧诱导响应元件、干旱响应元件等。这表明MdPMEs 基因具备响应多种非生物胁迫的分子基础，为植物在胁迫条件下通过调控果胶去甲酯化以改变细胞壁的可塑性与机械强度、增强细胞抗逆能力提供了前提条件[21，38]。此外，MdPMEs基因启动子区含有茉莉酸甲酯、赤霉素、脱落酸、水杨酸、生长素等激素响应元件，预示着MdPMEs 在果实生长发育过程中响应激素水平的变化，通过调节果胶甲酯化状态，进而影响果实品质形成与抗逆性。值得注意的是，MdPMEs 启动子中存在大量MYB转录因子结合位点（参与光响应、类黄酮合成及干旱应答等）[39-41]，表明MYB转录因子可能通过调控MdPMEs 基因表达进而影响果实的抗逆性和品质。
PME作为植物细胞壁修饰的关键酶之一，介导的果胶去甲酯化修饰对植物的生长发育具有重要影响[42]。果胶的去甲酯化与细胞壁硬度密切相关，细胞快速扩张时，需要高甲酯化的果胶以维持果实较高的硬度；当停止生长后，低甲酯化果胶排列在细胞外壁，从而改变细胞壁硬度[3]。对蜜脆苹果果实的研究发现，16个MdPMEs基因在苹果果肉不同发育阶段呈现差异表达模式，表明该基因家族成员可能在果实发育过程中发挥不同的作用。MdPME40、MdPME46 和MdPME79 在苹果果肉各发育阶段均呈高表达，该结果与草莓中的研究结果一致[43]，推测其可能有助于维持果胶稳定性，防止细胞壁过早降解。低甲酯化果胶可通过Ca2+交联增强细胞壁刚性，以支撑细胞形态、抵御外界机械损伤或病原菌入侵[28]。MdPME13、MdPME15 在成熟期呈高表达，与果胶甲酯化程度呈降低趋势的报道相符[28，44]，推测其催化果胶去甲酯化，为多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶等果胶修饰酶提供作用底物，进而驱动果实成熟软化过程。MdPME42 在果实低温贮藏期被明显诱导表达，提示其可能在果实应对贮藏环境变化、维持果实品质和抗逆性方面扮演关键角色。此外，蛋白的互作关系网络分析结果同样表明PME 与其他果胶修饰酶共同参与果胶的修饰或降解过程，以调控果胶的结构与稳定性，进而参与植物生长发育、果实成熟、逆境响应等关键生理过程。
4 结论
在苹果中鉴定出82个MdPMEs基因，并系统分析了理化性质、基因结构、保守基序、进化关系、基因表达模式和蛋白互作网络。进一步筛选出6个与果实发育过程密切相关的候选基因。本研究为后续在苹果及其他园艺作物中PME 基因的功能及作用机制研究提供了参考。
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