内生菌产红青霉SF-08对核桃幼苗定殖能力的影响

在生物防治领域，植物内生菌对病原菌的拮抗作用具有重要意义[1]。内生真菌是指能够在植物组织内部完成部分或全部的生活史，且宿主植物不表现明显病理症状的真菌类群[2]。内生真菌的定殖能力是决定其环境适应性的关键因素，直接影响其在复杂生态位中的存活动态，显著调控其对靶标病原菌的拮抗作用。内生真菌的强定殖能力使其能够在土壤微域、根际圈层及植物内生态位等异质性生境中高效建立种群优势，进而通过抢占生态位和竞争资源有效抑制病原微生物的侵染与定殖。本实验室在前期研究中分离获得1株广谱抗菌活性的内生拮抗真菌SF-08，经分子鉴定确认其分类地位为产红青霉（Penicillium rubens），隶属于青霉属[3]。探究SF-08的定殖能力，对未来的开发利用具有重要意义。定殖能力是根际促生菌（PGPR）和内生真菌发挥生物防治和促生作用的关键，直接影响其在农业和生态系统中的应用。微生物在植物体内外的定殖过程受植物信号“呼救”反应、根系分泌物、微生物趋化性及宿主基因型等多重因素调控，并涉及与土著微生物群落复杂的协作与竞争关系[4]。为深入研究定殖机制与动态，绿色荧光蛋白（GFP）标记技术被广泛应用。例如，丁婷等[5]利用农杆菌介导法成功标记了杜仲内生真菌Colletotrichum sp. DZJ07-6，发现GFP标记菌株DZJ07-6在菌落形态、拮抗特性及对小麦纹枯病的防效上与野生型无显著差异，且能在小麦根、茎组织的细胞间隙和细胞内有效定殖。李金等[6]建立枸杞内生真菌Fusarium sp. NQ8GII4的聚乙二醇介导GFP转化体系，优化原生质体制备与转化条件，筛选出遗传稳定且生物学特性无显著改变的转化子NQ-D-47。NQ-D-47能在枸杞根部高效定殖且定殖率达93.95%，显著促进植株生长，如株高增加了79.68%，并通过提高宿主防御酶活性多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）极大增强对枸杞炭疽病的抗性，防效达93.33%[7]。以上这些研究凸显了定殖能力对内生菌在寄主体内发挥其生物学功能的重要性。因此，建立标准化的定殖能力评价体系是未来的研究重点之一。

遗传标记技术，特别是利用报告基因如GFP，是研究微生物与其宿主互作机制的关键手段，能够实现对微生物在宿主体内定殖、扩散等行为的原位可视化追踪[8]。在丝状真菌遗传操作中，PEG介导的原生质体转化法应用广泛，该方法依赖酶解法生成原生质体，并借助PEG的作用实现外源DNA向受体基因组的导入与整合[9]。本研究拟建立并优化SF-08的PEG介导遗传转化体系，通过导入含GFP基因的质粒pCT74，筛选并评价获得的标记转化子在遗传稳定性、表型特征、拮抗活性等方面与野生型菌株的一致性，为后续研究其与宿主互作的时空动态与空间分布打下基础。

传统的拮抗菌检测方法，如形态学鉴定或分离培养，通常耗时长且灵敏度有限，难以满足精准检测的需求[10]。实时荧光定量PCR技术有着高特异性、高灵敏度和高通量等优势，已广泛应用于植物拮抗菌的快速定量检测。然而，内生拮抗菌株寄生核桃幼苗不同组织、不同生长时间点的生物量的定量qP-CR检测技术目前尚未报道。本研究拟建立并应用基于特异性引物（F/P-Pr）的实时荧光定量PCR检测体系，对不同生长天数的核桃幼苗不同组织中的SF-08进行DNA拷贝数定量分析，以快速、准确评估核桃幼苗不同组织中拮抗菌的定殖情况，为深入研究SF08与寄主互作机制打下基础。本研究利用激光共聚焦显微镜观察SF-08在核桃幼苗组织中的空间分布特征。进一步采用实时荧光定量PCR技术，对不同时间点各组织中SF-08的DNA拷贝数进行定量分析，以动态监测其定殖水平。本研究旨在通过准确评估SF-08的定殖能力，为深入研究SF-08与寄主的互作机制以及真菌在核桃病害生物防治中的应用潜力提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及载体 野生型菌株SF-08（专利号：CN117946872A）、赤壳菌SF-01、球毛壳菌SF-05、淡紫拟青霉菌均从新疆阿拉尔市甘泉镇（海拔1011 m）健康核桃根部分离获得。核桃树腐烂病菌Cytospora chrysosperma菌种亦被使用。所有菌种均保存于塔里木大学南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室。pCT74质粒购自Agilent公司，于-80 ℃避光保存。pUCm-T载体及DH5α感受态购自上海生工生物公司，于-20 ℃避光保存。

1.1.2 培养基及试剂 核桃种子采自温185号。LB培养基：5g酵母浸粉、10g蛋白胨、5g NaCl、1000mL去离子水。马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）：200 g马铃薯、20 g蔗糖、0.2 g NaCl、20 g琼脂、去离子水1000 mL；马铃薯蔗糖培养基（PSB）：200 g马铃薯、20g蔗糖、0.2 g NaCl、1000mL去离子水；MEB培养基：20 g麦芽提取物、20 g葡萄糖、1000 mL去离子水。固体再生培养基：200g马铃薯、182 g山梨醇和20 g琼脂；半固体再生培养基：200 g马铃薯、182 g山梨醇和10g琼脂，均经120 ℃灭菌20min。

主要试剂：氨苄青霉素（Amp）、潮霉素B（HmB）、STC溶液（1.2mol·L-1山梨醇、10mmol·L-1 Tris-HCl pH 7.5、50 mmol·L-1 CaCl2）、2×STC溶液（2 mol·L-1山梨醇、100mmol·L-1 Tris-HCl pH8.0、100mmol·L-1 CaCl2）、0.5mol·L-1NaCl及60%PEG4000。

1.1.3 酶、引物及试剂盒 采用崩溃酶driselase（solarbio）和溶壁酶lysing enzyme（上海源叶生物科技）。2种酶均以15mg·mL-1的浓度（ρ，后同）溶解于预冷的0.5mol·L-1NaCl溶液中，在28 ℃、120r·min-1条件下振荡30 min制备裂解液，并经0.22 μm微孔滤器过滤除菌。GFP特异性引物（Pr1：5′-TCCC-GCTGATGGACCCGTAATG-3′、Pr2：5′-AGCATGT-GCTTCCAGCTTGACTG-3′）由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。SF-08真菌菌丝体基因组DNA提取采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（天根生化科技，北京）。

1.1.4 野生型真菌特异性引物及探针组合的设计产红青霉菌基因序列来源于美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库。用于实时荧光定量PCR（qP-CR）的引物及探针由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，具体序列见表1，并于-20 ℃避光保存。

1.2 方法

1.2.1 菌株SF-08对HmB的敏感性测定 SF-08菌株菌丝体接种于含0、100、200、300µg·mL-1HmB的PSA固体培养基，于23 ℃恒温培养5d。测量5d后的菌落直径，以评估HmB的抑制作用并确定SF-08菌株的最低抑菌浓度。

1.2.2 pCT74质粒的提取及验证 将1 mL pCT74质粒菌液接种于50mL含80µg·mL-1AMP的LB培养基，35 ℃、150r·min-1过夜培养。采用质粒快速提取试剂盒提取质粒DNA。以提取的质粒为模板，用GFP特异性引物Pr1和Pr2进行PCR扩增。PCR程序：98 ℃预变性1 min；35个循环（98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸6 min）；72 ℃终末延伸1 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定合格的质粒-20 ℃保存。

1.2.3 产红青霉SF-08菌株原生质体的制备 SF-08菌株在PSB培养基中25 ℃、120 r·min-1培养120 h。取3 mL初培养菌液转接至50mL新鲜PSB培养基，继续25 ℃、135 r·min-1培养48h。菌丝体经三层无菌擦镜纸过滤收集，用预冷0.5mol·L-1NaCl溶液洗涤两次。称取约1 g鲜质量菌丝体，加入10mL裂解液，28 ℃、120 r·min-1酶解2 h。酶解产物经两步过滤收集滤液，再经4000 r·min-1离心5 min收集原生质体沉淀。沉淀用10 mL STC溶液洗涤后，4000 r·min-1离心10 min。原生质体用STC溶液重悬，浓度调整至1.5×107～2.5×107 cells·mL-1，用于后续转化试验。

1.2.4 原生质体转化技术 取1 mL原生质体，依次加入20µg pCT74质粒、20µL2×STC缓冲液及20µL 60% PEG4000溶液，室温孵育20 min。补加1.5mL60%PEG4000，继续室温作用5min。反应终止后，加入5 mL STC溶液，3000 r·min-1离心10min收集沉淀。沉淀用1 mL2×STC缓冲液重悬后，接种于预冷至50 ℃、80µg·mL-1Amp和200µg·mL-1 HmB的再生半固体培养基。混匀后，迅速倒置于已铺有一层再生固体培养基的平板上。待培养基凝固，平板倒置于25 ℃培养，直至转化子菌落形成。

1.2.5 转化子菌株的拮抗活性测定 为评估转化子与内生真菌SF-08对核桃腐烂病病原菌（C. chrysosperma）拮抗活性的一致性，本研究采用两种接种条件测定。第一种为同时接种：在PSA培养基上同时接种转化子与病原菌，观察并计算抑制率；第二种为预接种：先接种转化子，培养4d后接种病原菌，观察并计算抑制率。

1.2.6 转化子菌株的荧光检测及稳定性分析 从第一代菌落边缘挑取菌丝，蓝光下利用荧光显微镜进行初步观察。筛选出的荧光阳性菌落，首先在200µg·mL-1HmB和80µg·mL-1Amp的PSA平板上连续传三代。随后，将最后一批转化子菌落转移至不含抗生素的PSA平板上，并再次连续传三代。整个传代过程中，各代菌落的荧光表达均通过荧光显微镜进行检测。

1.2.7 转化子对核桃幼苗的侵染与定殖检测（1）菌株孢子悬液的制备。SF-08转化子菌株在PSA平板上培养后，挑取适量菌落接种于MEB液体培养基中，于28 ℃、180 r·min-1振荡培养72 h。培养结束后，用纱布过滤菌液制备孢子悬液，用血球计数板计数孢子浓度，并调整孢子悬液至1×107cells·mL-1。

（2）核桃幼苗的培育与接种。挑选饱满健康的核桃种子，用纯净水浸泡24h使其充分吸水。将种子移栽至灭菌营养土中，发芽后施加转化子孢子悬液，继续培养5～7d。设野生型菌株处理幼苗为对照组，未接种菌株幼苗为空白对照组。

（3）转化子菌株的定殖检测与GFP基因的PCR检测。采用常规石蜡切片法制备核桃幼苗叶、茎、根组织切片，荧光显微镜下观察菌株定殖部位[11]。用真菌基因组快速提取试剂盒，提取野生型SF-08及筛选后的转化子SF08gfpF-2菌株基因组DNA。从被野生型菌株及转化子（SF-08、SF08gfpF-2、SF08gfpF-46）侵染的核桃幼苗根、叶组织中，将液氮研磨匀浆后，使用同一试剂盒提取菌株DNA。随后，采用GFP特异性引物Pr1和Pr2对所有DNA样品进行PCR扩增。扩增条件：98 ℃预变性1 min；35个循环（98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸6 min）；72 ℃终末延伸1 min。扩增产物4 ℃保存。最终，扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测，以野生型菌株基因组DNA为对照。

1.2.8 反应体系及反应条件优化 以SF-08基因组DNA为模板，基于Ct值平台期筛选引物与TaqMan探针的最优终浓度，测试范围为0.2～0.5µmol·L-1。最终25µL反应体系配置：12.5µL2×qPCR Master Mix、最优浓度的引物和探针、2.0µL模板DNA，并用灭菌去离子水定容。

1.2.9 引物及探针的特异性验证 以赤壳菌（Dactylonectria torresensis）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）及淡紫拟青霉菌（Purpureocillium lilacinum）三种拮抗真菌的基因组DNA作为阴性对照，验证所建立的多重荧光定量PCR体系的特异性。

1.3 标准质粒DNA的构建

以SF-08基因组DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增。50µL反应体系包含25µL2×qP-CR Master Mix，1µL模板，各2µL 10µmol·L-1引物，用ddH2O定容。反应程序：95 ℃预变性3 min；随后35个循环，每个循环95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s及72 ℃延伸30 s。测序确认的PCR产物克隆至pUCm-T载体，转化DH5α扩增。提取的重组质粒经OD260测定，计算拷贝数（copies·mL-1），公式如下：

1.3.1 多重实时荧光定量PCR方法的建立与性能评估 将含SF-08目标基因片段的标准质粒DNA稀释至1.5×109 copies·µL-1，并进行10倍梯度稀释，制备1.5×109～1.5×103copies·µL-1的7个浓度梯度，结合阴性对照（ddH2O）构建qPCR标准曲线。各浓度进行3次重复qPCR检测，基于Ct值计算组内、组间变异系数（CV/%），以评估方法的重复性。

1.3.2 产红青霉SF-08菌株不同组织不同时间点菌株数量的检测 选用生长一致且培育42d的一年生核桃幼苗进行接种。幼苗种植于内层无纺布盆（60mm×60mm×70mm）中，该盆置于外层塑料盆（120 mm×100 mm×100 mm）内，土壤为根际土壤。所有用于幼苗种植的土壤理化性质均保持一致。产红青霉SF-08孢子悬液的配制浓度为1×106 CFU·mL-1。每处理组（SF-08处理组、对照组等）设置27盆幼苗。

接种后，以7 d为取样间隔，在第7、14、21、28、35及42天，从每个处理组中随机选取5株幼苗作为样本。移除无纺布盆后，收集根部抖落的根际土壤，并用PBS溶液冲洗根部。根、茎、叶组织经冷冻干燥、液氮研磨后于-60 ℃储存。提取各组织总DNA，调整浓度至20 ng·µL-1，用于SF-08的实时荧光定量PCR检测。通过Ct值结合标准曲线，定量计算SF-08的DNA拷贝数。

1.4 统计分析方法

数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对不同菌株间的差异进行显著性检验，并采用Duncan多重比较法进行均值比较；P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株SF08对HmB的敏感性测定

如图1显示，SF-08菌株在0、100、200、300µg·mL-1 HmB的PSA培养基上进行培养，5 d后观察结果。结果显示，在200µg·mL-1 HmB条件下，SF-08菌株生长受到显著抑制，仅表现出微弱生长；而当HmB浓度增至300µg·mL-1时，菌株生长则完全被抑制。因此，为确保有效筛选并允许转化子恢复生长，确定200µg·mL-1 HmB为后续原生质体再生及转化子筛选的最佳选择压浓度。

2.2 SF08菌株原生质体的制备与转化

对经过2 h酶解处理的SF-08菌株菌丝体进行显微观察，确认成功获得了原生质体。图2显示，这些原生质体（A、B）呈现为直径不一的球形结构，且其形成方式（C、D）主要发生在菌丝顶端。此外，比较分析转化子与野生型菌株的菌落形态发现，二者无显著差异（图3）。

2.3 转化子的筛选

为筛选表型与野生型菌株一致的转化子，对各转化子的生长速度和产孢量进行了测定与比较。统计分析结果表明，在所有转化子中，共有11株在生长速度和产孢量方面与野生型相比差异不显著（P＞0.05）。综合两项表型指标，最终筛选出11株生长速度和产孢量均与野生型无显著差异的转化子，分别为F-2、F-5、F-9、F-13、F-15、F-16、F-21、F-37、F-46、F-48和F-50（表2）。这些转化子在生物学特性上与野生型高度一致，可用于后续研究。

2.4 转化子拮抗活性检测

为评价转化子与内生真菌SF-08拮抗能力的一致性，测定了11株转化子对核桃腐烂病病原菌（C.chrysosperma）的抑制效果。在同时接种条件下，所有转化子均表现出一定的抑制作用（表3）。差异显著性分析结果表明，转化子F-5、F-48和F-50的抑制率显著低于野生型菌株（P＜0.05）；而F-2、F-9、F-13、F-15、F-16、F-21、F-37和F-46的抑制效果与野生型菌株差异不显著（P＞0.05）。说明转化过程可能对部分转化子与拮抗活性相关的代谢途径或基因表达产生影响。

先接种内生真菌转化子4d后再接种病原菌时，整体抑菌效果较同时接种有所增强（表3）。差异显著性分析结果表明，转化子F-2、F-37和F-46的抑菌率均显著高于野生型菌株（P＜0.05），其中F-2较野生型提高13.87%；转化子F-9、F-48和F-50的抑菌率显著低于野生型菌株（P＜0.05）；F-5、F-13、F-15、F-16和F-21的抑菌效果与野生型菌株差异不显著（P＞0.05）。

根据转化子拮抗活性评估结果，初步筛得F-2、F-46、F-21和F-37等4株转化子。其中，在后接种条件下，F-2、F-37和F-46的抑制率均显著高于野生型菌株；结合产孢量、拮抗活性及整体生物学功能等指标，最终选择F-2作为代表性的靶标标记菌株，用于后续研究。

2.5 转化子的荧光稳定性分析

对转化子进行的荧光检测表明（图4），其菌丝能够在470～520 nm蓝光波长激发下发出强绿色荧光。为验证该荧光标记的遗传稳定性，分别在选择性（含HmB和Amp）和非选择性PSA培养基上进行了连续传代。结果显示，经过3次选择性传代培养和1次非选择性传代培养后，转化子的绿色荧光均能持续表达且强度稳定。

2.6 转化子对核桃幼苗的侵染与定殖检测

通过激光共聚焦显微镜对经转化子F-2孢子悬液培养的核桃幼苗根、茎、叶进行检测，结果显示（图5），核桃幼苗的根、茎、叶各组织中均可见带有绿色荧光的转化子菌株，且菌株主要定殖于细胞间隙。对照组野生型菌株孢子悬液处理组及未加菌处理组核桃幼苗均未检测到绿色荧光。核桃幼苗侵染试验结果进一步表明（图6），转化子和野生型菌株处理的核桃幼苗长势均显著优于空白对照组，二者对核桃幼苗具有相似的促生长作用。以上结果证实已成功获得标记菌株SF08gfpF-2，且该菌株能够在核桃幼苗组织内有效定殖。

2.7 转化子和核桃幼苗中GFP基因PCR检测

PCR检测结果为GFP基因的成功转化及体内定殖提供了分子证据。通过比较野生型菌株（SF-08）与转化子（SF08gfpF-2）的PCR产物，在后者中检测到约425 bp的预期GFP条带。进一步对核桃幼苗进行检测，发现仅在经转化子（SF08gfpF-2、SF08gfpF-46）侵染的幼苗根、叶组织中能扩增出相同大小的目的条带，而在未侵染对照（SF-CK）及野生型菌株（SF-08）侵染的幼苗中则无此条带（图7）。以上结果表明，GFP基因不仅成功整合到菌株基因组中，并且携带该标记的转化子能够有效侵染并定殖于核桃幼苗的根和叶。

2.8 qPCR引物及探针的特异性检验

赤壳菌（Dactylonectria torresensis）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）及淡紫拟青霉菌（Purpureocillium lilacinum）阴性对照基因组DNA检测结果显示，三组重复均无荧光信号及交叉反应（图8）。荧光信号仅在目标菌株产红青霉（Penicillium rubens SF-08）DNA样品中检出，证实该检测方法具有高度特异性。

2.9 产红青霉SF08多重实时荧光定量PCR的建立

通过绘制Ct值对标准质粒拷贝数对数值作图获得扩增曲线（图9）。该多重检测方法在1.5×103～1.5×109copies·µL-1范围内线性良好，灵敏度优于常规PCR，且结果与单重体系检测一致（图10）。标准曲线线性相关性极佳（R2＞0.99），扩增效率达98%。阴性对照无扩增。设定Ct≤35为阳性判断标准，结果显示相同拷贝数浓度的SF-08 DNA在单重与多重体系中的Ct值无显著差异。

2.10 多重实时荧光定量PCR检测方法稳定性评价

通过对4种浓度1.5×104～1.5×107 copies·µL-1的SF-08标准质粒进行重复性检验，组内CV为0.23%～0.3%，组间CV为0.94%～1.05%（表4）。这些结果证实了该检测方法的高稳定性和良好重复性。

2.11 SF-08菌株数量的动态检测

以核桃幼苗不同组织为模板进行荧光定量PCR，产红青霉SF-08菌株在根组织中的DNA拷贝数自接种第7天的4.65×105 copies·g-1快速上升至第14天的446.33×105 copies·g-1，并于第21天达到峰值495.7× 105 copies·g-1，随后呈逐步下降趋势，第42天降至32.47×105copies·g-1，但仍高于第7天的水平。表明菌株在根系中具备较强的初期定殖能力及一定的持续存在性。茎组织中菌株DNA拷贝数量表现出类似变化趋势，第7天为1.96×105copies·g-1，第14天升至278.7×105 copies·g-1，至第21天回落至210.02×105 copies·g-1，在28至35天期间保持相对稳定，至第42天降至20.5×105 copies·g-1（表5）。该结果显示菌株能够由根部向茎部扩散，但扩散强度及定殖水平低于根组织，且随时间延长呈减弱趋势。叶片中的菌株DNA拷贝数整体较根茎组织低，以第28天时出现的2.42×105copies·g-1为局部峰值，随后明显下降，第42天降至0.047×105 copies·g-1，低于第7天的水平，这表明菌株在叶片的定殖较为有限且持续时间短，可能受到叶片环境条件或菌株自身特性的制约。

3 讨 论

3.1 产红青霉SF-08GFP标记与示踪

GFP在活细胞中具有稳定的表达特性，便于实时观察，且无需外源底物即可实现直接定位检测，已广泛应用于真菌定殖的标记与实时追踪[12]。目前，GFP基因与真菌基因组的整合方法已非常成熟，如载体构建融合表达法[13]、PEG介导法[14]、农杆菌介导转化法[15]、阳性筛选与表达验证[16]等。本研究突出了原生质体转化法的优势，转化效率高，不存在物理屏障，还便于多种DNA形式导入，这是在基因整合方法选择方面对前人研究[17]的改进。陈思杰等[18]采用醋酸墨水染色法观察枸杞根系内生真菌，仅能区分丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）和深色有隔内生真菌（dark septate endophytes，DSE），且背景易受干扰，染色效果不佳。本研究使用的GFP转染技术可直接表达绿色荧光蛋白，能够实时、高灵敏、高特异性地标记内生真菌，有效避免背景染色干扰，提升了观察的准确性与便利性。真菌的细胞壁是一个复杂且多层次的结构，主要由几丁质和各种葡聚糖构成，同时还可能含有甘露聚糖和蛋白质等其他组分。不同真菌物种之间，以及同一物种不同生长阶段，其细胞壁组成和结构均存在一定差异，其中新鲜菌丝的细胞壁通常较薄，因而更易降解。由于细胞壁包含多种不同化学键的聚合物，单一酶液通常只能降解细胞壁的某一种或少数几种组分。如果只使用一种酶，即使酶的浓度很高，也可能无法完全分解所有细胞壁成分，导致原生质体释放效率低下或需要更长的分解处理时间。混合不同种类和浓度的酶液可以靶向细胞壁的多种不同组分，从而更全面、高效地分解细胞壁。本研究参考Souza等[19]的方法，采用不同浓度和种类酶液混合制备的裂解液处理新鲜菌丝，能显著提高菌株原生质体的得率，提升了试验效率。

原生质体分离方案的优化需依据后续分子生物学应用的具体需求进行调整。酶解液是培养基制备过程的核心反应介质，酶浓度与作用时间需精确调控[20]；同时，严格控制机械应力及渗透环境是建立维持原生质体生存能力与结构完整性所必需的基础条件[21]。本研究确定了200 μg·mL-1 HmB为原生质体再生及转化子菌株筛选的抗生素选择压力，菌株在此浓度的PSA平板上基本不生长。再生培养基中添加80 μg·mL-1Amp用于pCT74质粒抗性压筛选，可显著提高转化成功率。在转化子筛选过程中发现，平板边缘菌落后续分子验证成功率较低，因此实际操作中宜优先选取平板中央、生长状态稳定的转化子进行筛选。此现象与陈楠等[22]标记水稻内生真菌JP4-1结果一致。平板边缘的营养成分分布可能与平板中心的存在差异。在平板制备和培养过程中，首先，由于扩散等因素，平板边缘的营养物质相对较少，这可能影响了转化子获取足够的养分来支持质粒的摄取。其次，平板边缘的水分蒸发速率相对较快，导致局部环境相对干燥，不利于转化过程中DNA的转移和整合，进而影响了质粒在转化子中的成功获取[23]。此外，在转化过程中，平板边缘的细胞可能受到的机械应力相对较大[24]，这也可能对细胞的完整性和转化效率产生负面影响，使得质粒难以成功导入转化子细胞内。pCT74质粒上携带一个能够赋予P. rubens SF-08对Amp产生抗性的基因，不同添加浓度对菌株生长具有显著影响，在某些浓度条件下菌株生长受到明显抑制，甚至几乎不生长，未转化的菌株（即没有成功摄取pCT74质粒的菌株）由于不含有Amp抗性基因，会被抑制生长。成功转化的菌株由于获得了Amp抗性基因，能够表达相应的抗性蛋白，从而能在含有Amp的培养基中存活和生长。

转化子之间的拮抗活性可能源于SF-08转化子优先于野生型SF-08菌株及病原菌，占据了组织内的生态位点，从而显著降低病原菌侵染概率；部分转化子可能诱导野生型SF-08产生抗性，该抗性不同于传统的系统获得性抗性，而表现为结构性抗性。例如将病菌生长局限在局部感染区。C. chrysosperma侵入后，转化子基因促使野生型SF-08合成防御物质，强化真菌细胞壁结构，有效阻挡C. chrysosperma入侵，实现病害防控，发挥预防效应。同时接种SF-08转化子与病原菌亦具一定防效，或因两者形成营养竞争，导致病原菌因营养不足而死亡；或转化子改变野生型SF-08防御代谢途径，对外来病菌产生抵抗。先施用SF-08转化子再接种病原菌时，转化子对C. chrysosperma仍表现出一定拮抗，原因可能是后者虽释放毒性代谢物或致病因子，但其侵染力和致病性受抑。接种量差异亦为影响内生真菌防控效果的关键因素。先接种SF-08转化子或先接种C. chrysosperma的顺序处理的防控效果均优于同时接种。SF-08转化子对C. chrysosperma的防控在发病后4d效果明显，但随时间延长抗性渐弱，表明其抗病性具时效性，可通过提高接种频次或采用转化子孢子悬浮液灌根延长植株抗性。

内生真菌可定殖植物组织内而不引发明显病害[25]。内生菌株产红青霉（Penicillium rubens）SF-08是核桃促生长内生真菌。丁婷等[6]认为外源基因导入虽实现特异性表达，但增加转化子代谢负担，致其生长特性改变。李爽等[26]通过检测绿色荧光确认目的基因稳定表达，结合致病性与稳定性分析，验证农杆菌介导转化体系能高效稳定导入目标基因至稻瘟病菌。本研究对68株SF-08稳定遗传转化子的生长速率和产孢量进行了评估。其中，35株和31株转化子在生长速率和产孢量方面与野生型相比无显著差异，而11株则表现出显著变化。推测其原因可能是外源DNA插入到与菌株生长发育相关的基因位点，破坏了相关基因的正常表达。然而，在多数情况下，被破坏的基因与表型变化之间并未表现出显著相关性[27]。转化子侵染核桃幼苗试验结果显示，荧光标记菌株可定殖于根、茎的细胞间隙及叶片中脉区域，表明其具备迁移能力，可从根部向茎和叶片传播。转化子处理的核桃幼苗促生长效果与野生型菌株处理组无显著差异，定殖部位可能与促生长机制相关。

3.2 产红青霉SF-08荧光定量体系的测定

Boyle等[28]用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，通过特异性引物扩增病原菌ITS序列量化病原DNA，比较样本的Ct值，结合标准曲线转换为绝对拷贝数以评估杨树对锈病的抗性。鉴于核桃促生内生真菌的种类多，单一菌株检测有局限性，本研究基于产红青霉特异性引物及TaqMan探针构建多重荧光定量PCR检测体系，可对不同时间点核桃幼苗中的SF-08进行定量检测。优化后的方法特异性高，能在非田间条件下检测1.5×103 copies·μL-1目的基因样品，灵敏度优于常规PCR，对低浓度基因组DNA检测灵敏度也高，比已有文献[29]报道的qPCR系统性能更优、重复性更好。

植物组织的取样方式会影响内生真菌丰度的检测结果[30]。本研究以核桃幼苗为材料，采用荧光定量PCR技术检测接种产红青霉SF-08孢子悬液后不同组织中菌株数量的动态变化。结果表明，根组织中SF-08菌株DNA拷贝数自接种后第7天起迅速增加，第14天明显升高，第21天达到峰值，表明其在根部具有较强的早期定殖能力；茎组织中的变化趋势与根组织相似，但扩散强度和定殖水平低于根部；叶组织中的菌株载量整体低于根、茎，且持续时间较短。

可能与不同组织的结构特征、生理功能及微环境差异有关[31]，根部作为初始接种部位，具有较大的接触面积、相对湿润的环境及较丰富的营养来源，更有利于菌株定殖和持续存留[32]；茎部主要发挥运输和连接作用，可为菌株向上扩散提供通道，但其定殖适宜性低于根部[33]；叶片则因暴露环境复杂、营养条件相对有限，并可能受到组织防御反应的影响，从而不利于菌株的稳定定殖[34]。因此，SF-08在核桃幼苗不同组织中的定殖水平表现出明显差异，整体呈现根部较高、茎部次之、叶部较低的分布特征。

4 结 论

本研究获得与野生型无显著差异的GFP标记产红青霉SF08gfpF-2，并结合激光共聚焦显微镜和qPCR证实SF-08可在核桃幼苗根、茎、叶内生定殖，其中根部定殖量最高。该结果为SF-08的生防应用提供了依据。

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Colonization ability of Penicillium strain SF-08on walnut seedlings

LIANG Qi,YU Yawen,HAO Shengzhe,Rezwangul·Tursun,LI Miaomiao,CHEN Xiaofei*

(College of Agriculture,Tarim University,Alar 843300,Xinjiang,China)

Abstract: 【Objective】The antagonistic fungus Penicillium rubens SF-08 has demonstrated potential in disease resistance promotion and broad-spectrum antimicrobial activity. However,a comprehensive understanding of its colonization mechanisms within host plant tissues,particularly its spatial distribution and colonization dynamics,remains largely undefined. This study aimed to investigate these aspects in Juglans regia L. seedlings in order to provide a scientific foundation for the rational application of SF-08 as a biological control agent.【Methods】The protoplasts of P. rubens SF-08 were prepared and subjected to polyethylene glycol(PEG)-mediated transformation using a plasmid containing a gene encoding green fluorescent protein (GFP) driven by a constitutive promoter. This genetic modification enabled stable expression of GFP within fungal cells for visualization. The transformants were rigorously screened based on stable GFP expression,consistent phenotypic characteristics (colony morphology,growth rate,and sporulation patterns) compared with the wild-type SF-08,and retained antagonistic activity against target pathogens through dual culture assays. A stable transformant,designated SF08gfpF-2,exhibiting robust fluorescence and antagonistic activity comparable to the wild-type,was selected for subsequent microscopic studies. To visualize SF-08 colonization,the walnut seedlings were inoculated with spore suspensions of the GFP-labeled SF08gfpF-2 strain. At various time points post-inoculation,root,stem,and leaf tissues were harvested,sectioned,and prepared for microscopic examination. Laser confocal microscopy was employed to observe the spatial distribution of the SF08gfpF-2 within the plant tissues. GFP’s inherent fluorescence facilitated direct,high-resolution visualization of fungal presence and localization. For quantitative assessment of the SF-08 colonization dynamics,the walnut seedlings were inoculated with spore suspensions of the wild-type SF-08 strain. At predetermined time points (0,7,14,21,28 days post-inoculation),the samples of the roots,stems,and leaves were collected. The total genomic DNA was extracted from these collected plant tissues using a standardized protocol optimized for plant-fungal composites. A quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assay was developed and optimized for the SF-08 detection. The specificity of the primers was validated against a panel of common plant pathogens and host plant DNA. The assay exhibited high specificity and an amplification efficiency exceeding 98%. A strong linear relationship (R2＞0.99) was established across a detection range from 1.5×103 to 1.5×109 copies per gram DNA,indicating high sensitivity and reliability. The DNA copy number of the SF-08 in each plant tissue sample was determined by comparing the cycle threshold (Ct) values to a standard curve generated from known concentrations of the SF-08 DNA.【Results】A stable transformant,SF08gfpF-2,with strong fluorescence and antagonistic activity comparable to the wild-type strain,was successfully obtained. The laser confocal microscopy revealed that the SF08gfpF-2 could invade and colonize the root epidermis,intercellular spaces of the root cortex,and vascular tissues of the walnut seedlings. Furthermore,the fungus extended its presence to the intercellular spaces of the stems and leaves,confirming its endophytic and cross-tissue colonization capability. The established qPCR assay demonstrated high specificity and amplification efficiency (＞98%),with a strong linear relationship (R2＞0.99) across the range of 1.5×103 to 1.5×109 copies per gram DNA,thus confirming its high sensitivity and suitability for quantitative analysis. The dynamic quantification results indicated that post-inoculation,the SF-08 initially established extensive colonization in the roots. Subsequently,the SF-08 DNA was detected with increasing abundance in the stems and leaves. A significant increase in the fungal load across all colonized tissues was particularly evident between 14 and21 days post-inoculation,after which colonization levels either stabilized or exhibited a gradual decline. This dynamic pattern would elucidate the processes of establishment,systemic proliferation,and persistence of the SF-08 within the walnut seedlings.【Conclusion】This study successfully leveraged genetic labeling,advanced microscopy,and molecular quantification to investigate the colonization patterns of the antagonistic fungus P. rubens SF-08 in the J. regia L. seedlings. The GFP-labeled SF08gfpF-2 transformant proved effective for visualizing fungal distribution. Through laser confocal microscopy and qPCR quantification,the SF-08 was confirmed to possess robust endophytic and systemic colonization capabilities within the roots,stems,and leaves of the walnut plants. The colonization process exhibited distinct spatiotemporal dynamics,characterized by initial extensive root colonization followed by systemic spread,with a peak in fungal biomass observed within 14to21 days post-inoculation. These findings would provide direct and substantial evidence for understanding the fundamental interaction mechanisms between the SF-08 and its host plant. The ability of the SF-08 to establish a systemic presence within walnut seedlings is important,as it supports its potential to exert systemic biocontrol effects against both foliar and root-associated pathogens. The elucidation of its colonization dynamics would offer a guidance for optimizing the timing and method of the SF-08 application as a biological control resource,aiming to maximize its efficacy in agricultural settings. This research would contribute to the knowledge of P. rubens SF-08 and its potential as a sustainable biopesticide for walnut cultivation and other plant systems.

Key words: Walnut;Fungal colonization;Penicillium rubens;Green fluorescent protein;Quantitative real-time PCR

DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20250502

中图分类号：S664.1

文献标志码：A

文章编号：1009-9980(2026)05-1247-15

收稿日期：2025-10-23

接受日期：2025-11-13

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31560007）；新疆生产建设兵团“三区”人才支持计划科技人员专项计划项目（BT1720230048G）

作者简介：梁琦，女，硕士，研究方向为植物保护。E-mail：3034137366@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：524683196@qq.com