梨（Pyrus）是我国第三大水果，栽培面积和产量仅次于柑橘和苹果。我国梨栽培面积和产量均居世界首位，占世界总量的70%左右[1]。梨树为多年生乔木，树型高大，根系广泛深植，但在单位面积上分布稀疏，用水量比一般农作物高[2]。近年来，气候变化和人口增长加剧了淡水资源短缺问题，梨树生产上经常遭受干旱胁迫的危害，影响梨树生长发育，进而限制其产量。在梨主产区，梨园对灌溉的依赖性增强，部分地区甚至出现地下水超采问题，水资源不足已成为限制梨产业效益和可持续发展的关键因素[3-4]。为缓解干旱缺水对梨树生产的影响，除推广节水灌溉技术外，通过传统育种或基因工程技术选育抗旱能力强的梨品种也至关重要。但由于梨树童期长以及遗传背景复杂，传统育种面临难度大、耗时长、效率低等问题[5]。随着梨基因组陆续公布，利用基因工程技术定向改良梨品种性状已成为未来育种的新方向[5]。近年来，国内外学者已发掘到多个参与调控梨抗旱性的基因资源。Li等[6]研究发现，异源过表达梨PbrMYB21的烟草抗旱性强于野生型，将此基因在秋子梨中瞬时过表达也可提高秋子梨的抗旱能力。瞬时沉默PbMYB7能够促进干旱下杜梨植株中活性氧的清除，进而提高植株的抗旱性[7]。异源过表达PbrATL18的拟南芥抗旱性增强，反之将PbrATL18在杜梨中瞬时沉默后植株则对干旱敏感[8]。U-box E3泛素连接酶PbPUB18在拟南芥中异源过表达可提高植株的抗旱性，在杜梨中将其瞬时沉默后则植株抗旱性减弱，表明其对梨干旱抗性具有积极调控作用[9]。随着多个与梨抗旱性调控相关的基因被报道，开展基因工程育种成为创制抗旱梨资源的可行途径，对推动梨产业可持续发展具有重要意义。
自噬是真核生物中广泛存在且进化上高度保守的细胞内物质降解途径，参与植物生长发育与免疫应答，当遭遇生物与非生物胁迫时能够帮助植物抵抗逆境[10]。研究表明，干旱能够显著提升香蕉、小麦、玉米等作物自噬活性，具体体现为自噬相关基因转录水平普遍上调及自噬体数量显著增多[11-17]。前人研究发现，过表达谷子自噬基因SiATG8a的拟南芥抗旱能力显著高于野生型[18]。相似地，过表达香蕉MaATG8f可以通过激活自噬通路与抗氧化防御系统，增强拟南芥对干旱的适应性[19]。此外，蚕豆中多个自噬基因ATG8a、ATG18b和ATG18c响应干旱胁迫，可作为潜在的基因资源改良蚕豆种子萌发耐旱能力[20]。研究发现，在干旱胁迫下，苜蓿脱水素蛋白MtCAS31与自噬蛋白MtATG8a、水通道蛋白Mt-PIP2;7互作形成MtATG8a-MtCAS31-MtPIP2;7复合体，介导MtPIP2;7经由自噬途径降解从而降低根系水导、减少水分流失，最终增强植株抗旱能力[21]。最新研究报道，外源褪黑素可以通过激活自噬途径减轻干旱下植株遭受的氧化损伤，从而以不依赖于ABA的途径提高棉花的干旱抗性[22]。以上研究表明，自噬在多种作物干旱胁迫响应过程中发挥重要作用，但目前自噬基因参与调控梨抗旱性的相关研究仍然较少。
自噬蛋白ATG5参与自噬体膜的延伸和形成，在自噬过程中发挥着极为重要的作用[23]。最新报道显示，梨自噬基因ATG5的表达受干旱、盐、冷等多种非生物逆境诱导[24]。基于以上基础，笔者首先克隆得到梨自噬基因PbATG5，通过实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）探究其在脱水胁迫下的表达模式，然后将PbATG5在拟南芥中异源过表达，同时利用病毒诱导基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技术在杜梨植株中将其瞬时沉默，以期明确其参与调节植株抗旱性的生物学功能，从而为利用基因工程对梨进行抗旱遗传改良提供理论支撑。
1 材料和方法
1.1 材料
植物试验材料为杜梨，拟南芥Col（Arabidopsis thaliana）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana L.），均来自石家庄学院现代农业科学与技术实验室。试验所用载体为基因克隆载体pMD-19T、亚细胞定位载体pRI101-GFP、植物表达载体pCambia2300以及VIGS载体（pTRV1和pTRV2），其中pMD-19T购自TaKaRa公司，其余载体均由本实验室保存。大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金生物科技有限公司，农杆菌感受态GV3101购自上海生工生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 PbATG5基因克隆及序列分析 以拟南芥AtATG5氨基酸序列为参考，利用NCBI Blastp获得梨PbATG5的预测序列，基于预测序列设计特异性克隆引物（表1），以杜梨幼叶cDNA为模板，克隆得到PbATG5基因序列。登录NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得其保守结构域信息。通过PLAZA（https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v3_dicots/）网站下载多个物种ATG5同源序列，通过MEGA 5软件构建邻接法系统进化树。提取PbATG5翻译起始位点（ATG）上游2000bp区域作为启动子序列，将其提交PlantCARE数据库分析启动子顺式作用元件。
表1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
用途Usage 引物名称Primer name 引物序列（5′-3′） Primer sequence(5′-3′)基因克隆 PbATG5 F：ATGGATATGGAAGCACAGAGGT Gene clone R：CTACCTACACATGTTATTGATTTGTG亚细胞定位 PbATG5-GFP F：CATATGCCCGTCGACATGGATATGGAAGCACAGAG Subcellular localization R：GCCCTTGCTCACCATCCTACACATGTTATTGATTTGT植物表达载体 PbATG5-2300 F：GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGATATGGAAGCA Plant expression vector R：GGGAAATTCGAGCTCGGTACCCTACCTACACATGTT沉默载体 pTRV2-PbATG5 F：TGAGTAAGGTTACCGAATTCAGAGGCTGCATATATAAT Vector for gene silencing R：GTGAGCTCGGTACCGGATCCGCATCTTCTAAATCATCA荧光定量 qPbATG1 F：TCATTGTCATCGTCCTCAAC qRT-PCR R：TCGGTCATCAAATCGGTG qPbATG5 F：TGTTGAGACACAAGGAGGAGA R：GCATCATCGTATTGGTTGC qPbATG6 F：GAAGTGCTTGGTGAGACTGATT R：CCGCTCCTCCAACTCCTTAA qPbATG7 F：GCTCTGATTACAGTTCCGCC R：CAAAGCACGCCATCTCAT qPbATG8 F：ACACTTTACCTCAAACAGCCAG R：TTCTCGCTGCTGTAACACA qPbATG10 F：CAGCAGCAACAGCAGCAT R：GCGTGGCATTATCAACAGACT qPbATG12 F：CCGAACCCAGACGAATTGGT R：TGCCATGGAGCAAGCATAGT Tubulin F：TGGGCTTTGCTCCTCTTAC R：CCTTCGTGCTCATCTTACC
1.2.2 亚细胞定位分析 将PbATG5编码区克隆至pRI101-GFP载体，通过电击转化导入农杆菌GV3101感受态细胞，将重组农杆菌注射健康烟草叶片，注射后将植株暗培养2d，而后置于激光共聚焦显微镜（FV1200，Olympus，Japan）下观察PbATG5蛋白的定位情况。
1.2.3 杜梨幼苗脱水处理 选取饱满的杜梨种子，在流动清水中浸泡24 h，而后将种子取出置于无菌离心管中，转移至超净工作台，用10%次氯酸钠消毒，随后用无菌水冲洗3次，接着用无菌尖头镊子去除杜梨种皮，将剥好的杜梨种子放置于培养皿的湿润无菌滤纸上，转移至植物培养箱催芽，待胚根长出后，将其转移至营养土培养，放置于植物培养室，培养室条件为温度25 ℃、光周期16 h（光照）/8 h（黑暗）、相对湿度70%左右。在植物培养室中生长45d后，选取长势一致、健康的杜梨幼苗作为试验材料，将其从土壤中小心取出放置于干燥的滤纸上进行脱水处理，在处理后0、0.5、1、3、6 h取样，液氮速冻后转移至-80 ℃保存。
1.2.4 基因表达分析 使用Wolact Plant RNA Isolation Kit提取植物总RNA，参照Thermo Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA第一链。针对需要进行表达量检测的基因设计定量PCR引物及内参基因引物（表1），并利用实时荧光定量PCR技术（罗氏LC96定量仪）对各基因的相对表达量进行检测，每样本包括3次生物学重复。
1.2.5 拟南芥转化及干旱处理 通过电击法将过表达重组质粒pCambia2300-PbATG5转化至农杆菌GV3101，而后采用花序浸蘸法进行拟南芥遗传转化[25]，单株收种筛选直至获得PbATG5过表达的纯合T3代转基因拟南芥种子，用于干旱处理。将野生型和纯合的转基因拟南芥种子消毒后分别点种于无抗以及抗性1/2MS培养基上，2周后取长势一致的拟南芥幼苗移栽至8 cm×8 cm黑色方钵（营养土等质量）中，每钵4株，而后置于植物培养室正常浇水培养。待拟南芥长至4周龄时，将健康、长势一致的苗子分为对照组和干旱处理组，每组处理12盆，每盆4株。处理开始前，将对照组和干旱处理组浇透水，第2天将托盘中多余的水分倒掉，此时记为处理第0天，而后对照组正常浇水，处理组则停止浇水，自然干旱处理14d，观察表型并取样冻存于-80 ℃超低温冰箱。
1.2.6 杜梨植株瞬时沉默及干旱处理 于PbATG5基因编码区序列中选取特异性片段并设计引物（表1），将其插入到pTRV2载体上的EcoRⅠ和BamHⅠ两个酶切位点中间，构建VIGS载体TRV2：PbATG5，并通过电击法将其转化至农杆菌GV3101。将含有TRV1的农杆菌分别与含有TRV2：PbATG5载体和TRV2空载的农杆菌等量混合后，注射至培养45 d的杜梨幼苗，在室温条件下避光保湿培养2～3 d，而后对注射TRV2的对照组和TRV2：PbATG5沉默组进行干旱处理。干旱处理采用自然控干法，将对照组和沉默株系浇透水，第2天将托盘中多余水分倒掉，将其置于植物培养室并停止浇水，待其出现表型时拍照并取样冻存于-80 ℃超低温冰箱。
1.2.7 生理指标测定 参照孙逊[26]的方法测定植株叶片中相对电导率、相对含水量（relative water content，RWC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量以及叶绿素含量。过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）含量、超氧化物自由基（superoxide radical，O2-）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性以及过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定。干旱处理2周后，利用3,3′-二氨基联苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB）和硝基蓝四唑氯化物（nitro blue tetrazolium，NBT）对野生型和异源过表达PbATG5的转基因拟南芥叶片进行染色，定性检测H2O2和O2-累积状况。干旱处理第7天，选取对照和沉默杜梨植株同等节位的叶片，于冰块上2.5%戊二醛缓冲液中避开叶脉切取2mm×2mm叶片小块，并抽真空固定，而后参照孙逊[26]的方法使用透射电子显微镜（JEOL-1230；Hitachi，Japan）观察叶片中自噬体累积情况。
1.3 数据处理与分析
试验数据以均值±标准差（n=3）表示，采用SPSS 27.0进行单因素方差分析（ANOVA），经Tukey's检验（P＜0.05）比较组间差异，不同字母标记表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 梨自噬基因PbATG5的克隆、序列分析与亚细胞定位
以杜梨cDNA为模板克隆得到梨自噬基因PbATG5。序列分析显示，PbATG5的完整开放阅读框为1110 bp，编码370个氨基酸，蛋白分子质量为41.37 ku，等电点为4.83（图1-A）。经NCBI保守结构域比对发现，PbATG5蛋白具有自噬蛋白APG5保守结构域，表明其在自噬功能上的保守性（图1-B）。将苹果、拟南芥、水稻、玉米、桃、葡萄、草莓、杨树、烟草、番茄、大豆与梨ATG5蛋白进行多序列比对，并使用MEGA11构建系统进化树。多序列比对结果显示，不同物种间ATG5结构域相似度较高，梨自噬蛋白ATG5与苹果、拟南芥、水稻、玉米、桃、葡萄、草莓、杨树、烟草、番茄、大豆ATG5蛋白序列相似度分别为91.21%、57.88%、50.39%、47.03%、82.43%、66.67%、71.06%、63.82%、61.76%、59.43%、58.66%（图2-A）。系统进化分析显示，梨ATG5蛋白与同属蔷薇科的苹果ATG5、桃ATG5以及草莓ATG5亲缘关系较近，与单子叶植物水稻、玉米亲缘关系较远（图2-B）。此外，亚细胞定位分析表明，梨自噬蛋白PbATG5主要在细胞膜与细胞核中表达（图3）。
图1 梨PbATG5基因克隆及保守结构域分析
Fig.1 Cloning and conserved domain analysis of PbATG5in pear
图2 梨PbATG5蛋白与其他物种同源蛋白多序列比对及系统进化分析
Fig.2 Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of the pear PbATG5protein with the homologous proteins from other plant species
图3 梨PbATG5蛋白的亚细胞定位
Fig.3 Subcellular localization of PbATG5in pear
2.2 梨自噬基因PbATG5启动子作用元件分析
通过分析梨自噬基因PbATG5起始密码子上游2000bp DNA序列，发现PbATG5启动子区富集了多种与植物激素应答和逆境胁迫相关的顺式调控元件（表2）。具体包括：脱落酸响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、乙烯响应元件（ERE）、水杨酸响应元件（TCA-Element）、生长素响应元件（TGA-Element），以及响应低温（LTR）和干旱（如DRE core、MBS、MYC）等胁迫的顺式作用元件。其中，PbATG5启动子区包含大量与植物干旱胁迫有关的作用元件（ABRE、DRE core、MBS、MYC），表明其可能参与调控植物干旱响应。
表2 PbATG5启动子顺式作用元件分析
Table2 Analysis of cis-acting elements in PbATG5promoter
顺式作用元件 序列 位置 功能Cis elements Sequence Position FunctionABRE ACGTG+1366，-294,-1669,脱落酸响应元件Abscisic acid responsiveness CGTCA-motif CGTCA+232,+400,+1592,-1208 茉莉酸甲酯响应元件MeJA-responsiveness ERE ATTTCATA+1250 乙烯响应元件Ethylene-responsive element DRE core GCCGAC -158,-1058 脱水响应元件Dehydration-responsive element LTR CCGAAA -862 低温响应元件Low-temperature responsiveness MBS CAACTG -584 参与干旱诱导的MYB结合位点MYB binding site involved in drought-inducibility MSA-like TCAAACGGT -1898 参与细胞循环调控的顺式作用元件Cis-acting element involved in cell cycle regulation MYC CATTTG -1375,+1194 参与干旱诱导的MYC位点MYC involved in drought-inducibility TCA-Element CCATCTTTTT -1049 水杨酸响应元件Salicylic acid response element TGA-Element AACGAC+1892 生长素响应元件Auxin-responsive element TGACG-motif TGACG+1208,-1592,-232,-400 茉莉酸甲酯响应元件MeJA-responsiveness
2.3 梨自噬基因PbATG5在脱水处理下的表达分析
实时荧光定量PCR结果显示，杜梨叶片中自噬基因PbATG5可以通过脱水处理诱导表达上调，且其在处理3 h上调倍数最大，上调约7.0倍，这进一步表明PbATG5极有可能参与梨响应干旱胁迫的生理生化过程（图4）。
图4 梨自噬基因PbATG5在脱水处理下的表达模式分析
Fig.4 Expression pattern analysis of pear autophagy gene PbATG5under dehydration
2.4 过表达PbATG5转基因拟南芥抗旱性鉴定
将梨自噬基因PbATG5异源转化拟南芥并单株收种至T3代，分别经DNA和RNA水平鉴定后，最终获得2个纯合的PbATG5过表达转基因拟南芥株系（图5-A～B）。选取健康、生长状态一致的野生型（wild-type，WT）以及2个异源过表达PbATG5的拟南芥株系（L1、L2），开展为期2周的自然干旱处理。正常供水条件下，WT与2个过表达株系均生长良好，表型无显著差异（图5-C）。干旱处理第14天时，相较于WT，异源过表达PbATG5的转基因拟南芥叶片萎蔫症状较轻。相对电导率、丙二醛含量、相对含水量、叶绿素含量可用于评估植物所受干旱损伤的程度。正常情况下，WT与2个过表达株系中的这4个指标无显著差异，但干旱处理后，WT叶片中相对电导率和丙二醛含量均显著高于异源过表达PbATG5的拟南芥株系（图5-D～E）。干旱胁迫下，所有株系的叶片相对含水量和叶绿素含量均显著降低，但过表达株系L1、L2中这2个指标均显著高于WT（图5-F～G）。以上结果表明，异源过表达PbATG5能够在一定程度上减缓干旱对植物的伤害。
图5 干旱胁迫下野生型与PbATG5异源过表达转基因拟南芥的表型与生理指标比较
Fig.5 Comparisons of phenotype and physiological index in wild-type(WT) and PbATG5-overexpressing(OE)Arabidopsis under drought stress
2.5 过表达PbATG5影响了干旱胁迫下拟南芥的活性氧代谢
活性氧组织化学染色结果显示，干旱胁迫下，野生型和转基因植株叶片中NBT与DAB染色深度明显增加，而异源过表达PbATG5的拟南芥叶片染色深度相比于野生型拟南芥较轻（图6-A）。进一步测定发现，与野生型拟南芥相比，干旱胁迫下过表达PbATG5的转基因株系叶片中H2O2和O2-积累水平显著降低（图6-B～C）。与此同时，干旱胁迫下野生型和转基因拟南芥中SOD活性显著提高，且转基因拟南芥中SOD活性增幅更大（图6-D）。以上结果表明，PbATG5有助于提高植株在干旱胁迫下的活性氧清除能力，从而对植株抗旱性起到正向调节作用。
图6 干旱胁迫下野生型与转基因拟南芥活性氧代谢分析
Fig.6 Analysis of reactive oxygen species(ROS) metabolism in WT and transgenicArabidopsis under drought stress
2.6 PbATG5瞬时沉默杜梨植株干旱胁迫下的表型
利用VIGS技术在杜梨植株中瞬时沉默PbATG5，实时荧光定量PCR结果显示，与对照植株（用空载转化）TRV:00相比，沉默株系TRV:PbATG5中PbATG5表达量显著下降，约为对照组的40.9%，表明PbATG5基因表达被成功抑制（图7-B）。选取生长一致的对照植株与杜梨沉默株系进行为期2周的干旱处理。干旱处理第14天时，沉默株系TRV:PbATG5出现了明显萎蔫症状，而对照植株萎蔫症状明显较轻（图7-A）。与表型相一致，干旱胁迫下，沉默株系叶片相对含水量显著低于对照植株，表明沉默株系保水抗旱能力相对较弱（图7-C）。相对电导率、丙二醛含量是评估植株细胞损害程度的常用生理指标。正常情况下，转化空载的对照植株与沉默株系的叶片相对电导率和丙二醛含量无显著差异。干旱处理后，对照植株和沉默株系中二者上述指标均显著升高，但沉默株系的增幅显著高于对照，表明沉默株系在干旱胁迫下所遭受的伤害程度高于对照（图7-D～E）。以上结果表明，沉默PbATG5降低了杜梨植株对干旱胁迫的抗性。
图7 沉默PbATG5对杜梨抗旱性的影响
Fig.7 Effects of PbATG5silencing on drought resistance of pear
2.7 PbATG5沉默对干旱胁迫下杜梨植株抗氧化系统的影响
干旱处理后，对照与沉默株系TRV:PbATG5中H2O2和O2-含量均显著增加，但沉默株系中活性氧含量增加幅度显著高于野生型，表明干旱胁迫下沉默PbATG5会导致植株遭受的氧化胁迫更严重（图8-A～B）。干旱胁迫下，对照植株和沉默株系叶片中SOD和POD活性均明显升高，但沉默株系中这两种酶活性上升幅度明显小于对照（图8-C～D）。以上结果表明，沉默PbATG5降低了杜梨植株在干旱胁迫下的活性氧清除能力。
图8 干旱胁迫下沉默PbATG5对杜梨植株抗氧化系统的影响
Fig.8 Effects of PbATG5silencing on antioxidant system of pear plants under drought stress
2.8 PbATG5沉默对干旱胁迫下杜梨植株自噬活性的影响
进一步测定了干旱胁迫下对照植株和PbATG5沉默株系（TRV:PbATG5）中6个关键自噬基因（PbATG1、PbATG6、PbATG7、PbATG8、PbATG10、PbATG12）的表达量及自噬体数量。干旱胁迫下，除PbATG7外，沉默株系TRV:PbATG5中其他5个被检测的自噬基因表达量均显著低于对照植株（图9-A）。透射电子显微镜分析进一步揭示，干旱胁迫下对照植株叶片中自噬体大量积累，其自噬体数量约为沉默株系（TRV:PbATG5）的4.9倍（图9-B～C）。以上结果表明，沉默PbATG5抑制了干旱胁迫下杜梨植株中自噬过程的激活。
图9 干旱胁迫下沉默PbATG5对杜梨植株自噬活性的影响
Fig.9 Effects of PbATG5silencing on autophagic activity of pear plants under drought stress
3 讨 论
随着全球气候变暖和梨产业西移，干旱已成为制约我国梨产业发展的重要因素[3]。发掘梨抗旱基因资源并利用基因工程创制抗旱新种质，是促进未来梨产业可持续发展的重要途径。作为真核生物中高度保守的物质降解途径，自噬在作物响应干旱胁迫过程中扮演着关键角色，但目前有关自噬参与调控梨抗旱性的报道仍然较少[16-18]。自噬蛋白ATG5作用于自噬泡的延伸与形成，是自噬途径中的关键作用因子，拟南芥自噬缺陷突变体atg5-1无法正常形成自噬体，生长发育受阻，且对多种逆境的抗性弱于野生型[10]。本研究从杜梨中克隆得到梨自噬基因PbATG5，其编码蛋白具有自噬蛋白APG5保守结构域，表明该蛋白在梨中具备保守的自噬功能[27]。亚细胞定位结果显示，PbATG5定位于细胞核和细胞质。梨自噬基因PbATG5启动子区域存在多个与干旱胁迫响应相关的顺式作用元件，其基因表达可受脱水胁迫诱导，合理推断PbATG5可能在梨干旱响应中发挥重要作用。VIGS技术能够使植物体内内源目的基因沉默并维持数周，现已广泛应用于棉花、梨、苹果等多种作物的基因功能研究[28-30]。为进一步探究PbATG5是否参与调节植物抗旱性，一方面将其异源转化拟南芥得到过表达转基因拟南芥植株，另一方面利用VIGS技术在杜梨植株中将其瞬时沉默，而后对PbATG5过表达转基因拟南芥和沉默PbATG5的杜梨植株进行干旱处理。研究表明，异源过表达PbATG5的拟南芥抗旱性强于野生型，在杜梨植株中将其瞬时沉默则显著降低了植株对干旱胁迫的耐受力，表明梨自噬基因PbATG5可正向调控植株抗旱性。
正常情况下细胞自噬处于较低水平，当遭遇逆境或者处于特殊发育阶段时，植物体内自噬被激活以降解受损的氧化蛋白，并循环利用其降解产物，从而帮助维持细胞稳态[31]。越来越多的研究表明，自噬活性与植物抗旱能力密切相关[32]。干旱胁迫下，苦荞麦叶片中自噬相关基因FtATG8s表达量显著增加，过表达FtATG8a可提高苦荞麦转基因根系对干旱胁迫的抗性[33-34]。拟南芥中，异源过表达闽楠PbATG8a或PbATG18b能够改善干旱下植株的自噬活性，进而提高植株抗旱能力[35]。桃自噬基因能够被干旱胁迫诱导，自噬活性增强，进而减轻干旱导致的器官伤害[36]。与前人研究结果一致，本研究中瞬时沉默PbATG5的杜梨植株中自噬基因表达量低于对照植株，其叶片中自噬小体数量也相对更少，因此其抗旱性低于未沉默PbATG5的对照植株。
相对含水量是衡量植物组织水分缺失程度的重要指标，常用于评价植株抗旱能力。干旱胁迫下，较低的叶片水分含量不利于植物光合作用，从而影响植物生长及产量，加速其衰老[37]。本研究中，干旱胁迫下异源过表达PbATG5的转基因拟南芥叶片相对含水量高于野生型，利用VIGS技术沉默PbATG5则导致杜梨植株叶片含水量降低，表明PbATG5有助于增强干旱下植物的保水能力。相对电导率和丙二醛含量是衡量植物膜系统完整性和氧化程度的重要指标，能够直接反映出胁迫下植物受伤害的情况[38]。作为经典的细胞物质降解代谢途径，自噬能够降解受损或有害蛋白质，循环利用其降解产物，从而维持细胞稳态[10]。相比于野生型，过表达MdATG10的转基因苹果抗旱性提高，表现为其叶片相对电导率和丙二醛含量均低于野生型[39]。盐胁迫下，过表达PagATG18a的转基因白杨叶片中丙二醛含量和相对电导率均显著低于野生型，其耐盐性也相对更强[40]。拟南芥中，异源过表达珙桐自噬基因DiATG3能够缓解高温对植株的伤害，表现为高温下转基因植株中丙二醛含量和相对电导率较野生型更低[41]。本研究中，干旱胁迫下，PbATG5异源过表达拟南芥叶片相对电导率和丙二醛含量低于野生型，而这两者在沉默PbATG5的杜梨植株叶片中则高于野生型，表明自噬在缓解胁迫对植物造成的细胞损伤方面有普遍性作用。以上结果表明，梨自噬基因PbATG5可能通过激活自噬维持细胞稳态，从而提高植物保水能力、缓解植物所遭受的干旱逆境伤害，最终正向调节植物抗旱性。
干旱可导致植株体内活性氧大量累积，进而损害多种细胞组分，对植物造成氧化胁迫[42]。前人研究发现，自噬能够降解植物体内氧化受损组分，减缓活性氧迸发，从而缓解逆境下植物所受的氧化伤害[43-45]。多项研究表明，自噬通过调节逆境下植物的抗氧化能力提高作物抗旱性[34，46-48]。拟南芥中，选择性自噬受体NBR1可识别蛋白聚集体使其经由自噬途径降解以缓解干旱胁迫导致的氧化伤害[48]。最新研究表明，在拟南芥中异源过表达苦荞麦自噬基因FtATG8a可通过增强植株抗氧化能力提高其对干旱的耐受程度[34]。本研究中，过表达PbATG5的转基因拟南芥在干旱下积累的活性氧相较于野生型更多，其体内抗氧化酶SOD、POD活性也相对更高，沉默PbATG5的杜梨植株活性氧积累与抗氧化酶活性水平变化情况则反之。因此，合理推断梨自噬基因PbATG5可能通过调节干旱下植株自噬活性，一方面直接作用于氧化受损蛋白及损伤线粒体的降解，缓解活性氧迸发；另一方面可能作用于改善植株抗氧化系统，促进活性氧清除从而减少干旱下植株中活性氧的积累，最终实现对植株抗旱性的正调控。这一结果与前人的研究结果一致，但目前研究大多集中于自噬通过影响氧化蛋白降解改善逆境下活性氧累积，其如何作用于调节植物抗氧化系统仍待进一步研究。
4 结 论
笔者从杜梨叶片中克隆得到自噬基因PbATG5，其开放阅读框全长1110bp，编码370个氨基酸，该基因编码的蛋白具有一个自噬蛋白APG5保守结构域，定位于细胞核和细胞膜中。梨自噬基因PbATG5启动子区域含有丰富的激素和逆境响应元件，其基因表达可受脱水胁迫诱导。干旱胁迫下，梨自噬基因PbATG5通过调节自噬活性，减少活性氧累积，从而缓解干旱胁迫对植株的伤害，最终实现其对植株抗旱性的正向调节。本研究结果为梨抗旱种质的遗传改良提供了理论基础和有价值的基因资源。
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