核桃（Juglans regia L.）系胡桃科核桃属多年生落叶果树，是世界著名四大干果之一[1]，不仅材质优良，而且还具有重要的经济价值、营养价值、药用价值[2]。但是随着核桃产业的不断发展，在薄壳核桃主栽品种中出现了缝合线不紧密、内果皮不同程度的“缺失”等现象，导致核桃仁污染率升高，进而降低其经济价值。研究发现，细胞壁在形成过程中受多种因素的影响，其中受激素的影响最为显著[3-4]，能够通过调控与木质部发育有关的基因表达，对植物次生壁的形成产生影响[5-6]。课题组研究发现，在早期新露核桃内果皮壳质态中的IAA 浓度远低于肉质态，硬化的后期又开始升高，而生长素IAA 在内果皮硬化过程中发挥着重要的调控作用[7]。
在1880年，达尔文（Darwin）发现植物中某种物质具有调控植物向光性生长的作用，通过后续研究发现该物质是生长素（auxin），其在植物中的主要存在形式是吲哚乙酸。随后，研究人员发现生长素在植物生长发育的整个过程（如建立胚胎极性、形成顶端优势和重力响应）中均发挥关键调控作用[8-10]。生长素的化学本质是吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA），在植物生长发育过程中通过调节细胞分裂、分化及细胞程序性死亡等过程来发挥作用。这些生长素应答基因主要包括AUX/IAA（auxin/ indole-3-acetic acid）、GH3（gretchen hagen 3）和SAUR（small auxin-up RNA）三大基因家族[11]。其中，AUX/IAA 属于早期生长素应答基因，在生长素信号转导的早期发挥着重要作用[12]。在低浓度生长素中，ARF 和AUX/IAA 蛋白形成异源二聚体[13]，并与TPL（topless）蛋白[14]、组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）相结合，从而抑制ARF对生长素的响应；在高浓度的生长素环境中，生长素通过与TIR1受体相结合，生成的SCFTIR1复合物通过泛素化打破AUX/IAA蛋白和ARF蛋白形成的二聚体，同时，蛋白酶降解AUX/IAA 蛋白使ARF 重新获得活性[15]。此外，AUX/IAA蛋白还具有4个（Ⅰ～Ⅳ）高度保守的结构域，他们是这些蛋白行使特异功能的基础[16]。位于蛋白N 端的结构域I 包含保守的亮氨酸重复序列LxLxLx，作为转录抑制因子对ARF的转录激活具有上位效应[17]。结构域Ⅱ保守的GWPPV 序列与F-box蛋白TIR1相互作用，从而调节AUX/IAA蛋白的降解。AUX/IAA的半衰期具有不确定性，主要取决于结构域Ⅱ的性质，结构域Ⅲ和Ⅳ则介导AUX/IAA同源蛋白之间或与ARF之间的互作[18]。
AUX/IAA 基因属于早期生长素响应基因，编码的AUX/IAA 蛋白在生长素信号转导途径中具有重要作用[19-21]。AUX/IAA 基因在双子叶植物和单子叶禾本科植物中均有发现，在动物、细菌和真菌基因组中则未见报道。因此，推测AUX/IAA 可能是植物所特有的一类基因[22]。在1982 年，Walker 等[23]在豌豆中发现首个AUX/IAA 基因，自此，不同植物中AUX/IAA 基因被陆续发现。目前，已对多个植物的AUX/IAA基因家族完成了基因组鉴定。拟南芥中发现了29 个AUX/IAA 基因家族成员[10]，水稻中有31 个[24]，高粱和马铃薯中均有26 个[25]，大麦中有36 个[26]，番茄中有25个[27]。但是，目前对核桃AUX/IAA基因功能的研究尚浅。因此，对AUX/IAA 基因家族在新露核桃不同时期不同激素处理下的表达模式研究具有重要意义。
通过对新露核桃AUX/IAA 基因家族进行全基因组鉴定和生物信息学分析，并进一步分析其基因结构、序列特征、表达水平等，充分探究AUX/IAA基因在核桃内果皮发育过程中的作用，以期为筛选关键候选基因奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
本试验以新疆阿克苏地区温宿县试验林场中新露核桃为试验材料，树龄均为16 a（年），株行距为5 m×6 m，选取生长健壮、水肥管理水平一致的果树进行试验。
于花后约50 d（6 月3 日）硬化期刚开始时，使用不同浓度（ρ，后同）（50、100、150、200 mg·L-1）的生长素（IAA），选取果实大小基本一致的短结果枝，在靠近果实的短果枝顶部上侧，用手术刀刮去约0.3 cm×1 cm 大小的外表皮。用棉棒蘸取适量激素均匀涂抹在伤口上，并用浸泡过激素的脱脂棉将伤口填充，封口膜包裹伤口，再用锡箔纸包裹，使伤口与外界环境隔离（表1）。从首次激素处理开始，每隔12 d采摘1次果实，直至硬化期结束，共采样4次，每个样本3 次生物学重复，其中6 月15 日和6 月27日分别称为T1 时期和T2 时期。激素处理时间为18：00 以后，光强较弱，并且在激素处理后4 h 无降水。激素种类：IAA（吲哚乙酸，生长素）、NPA（N-1萘基酞氨酸/1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸，生长素抑制剂）。核桃壳发育状态：肉质态（内果皮未硬化区域）；壳质态（内果皮硬化区域）[28]。
表1 试验处理分组
Table 1 Experimental processing grouping
激素种类Hormone type清水Water IAA NPA处理Treatment CK I1 I2 I3 I4 N1 N2 N3 N4 ρ（激素）Hormone concentration/（mg·L-1）0 50 100 150 200 50 100 150 200
1.2 方法
1.2.1 核桃AUX/IAA基因家族的鉴定 为了鉴定核桃中推测的AUX/IAA 基因家族成员特性，从课题组构建的核桃数据库（https：//walnut.ac.cn/WalnutGDB/）中下载核桃基因组的gff 文件、CDS 文件以及蛋白质序列文件；新露核桃基因组由本课题组完成测序并发表[29]，从PFAM 网站下载AUX/IAA 基因的结构域hmm 模型，使用hmmer 软件中的hmmersearch程序检索含有该结构域的蛋白序列，鉴定标准为E-vaule（E值）＜0.01，此外，对核桃的蛋白质序列文件执行本地化BLASTP 搜索，E 值小于1×10-20。对通过前述两种鉴定手段得出的蛋白质序列进行汇总，剔除出现重叠、缺乏全部编码框或者测序未能全面的蛋白质序列。将预备的AUX/IAA成分提交到Pfam（http：//pfam.xfam.org）和NCBI- CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）数据库中，检查其是否具备准确的结构区。从网站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）获得JrAUX/IAA 的等电点和分子质量，利用Euk-mPLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在线网站进行亚细胞定位分析。
1.2.2 JrAUX/IAAs 基因在核桃染色体上的分布通过对拟南芥蛋白和Jregia 基因组进行Blast 比对和Hmmer 搜索，共确定了63个AUX/IAA基因，所选用的核桃数据来自于（https：//venyao.xyz/Juglans-GDB）网站，拟南芥数据来自于（https：//plants.ensembl.org/index.html）数据库。染色体长度使用TBTools“FASTA stats”计算，使用表型光谱图工具创建chr表意图，其输出图像用于鉴定基因在染色体上的位置信息。
1.2.3 JrAUX/IAA 家族的系统发育分析 为探究JrAUX/IAA 之间的系统发育关系及功能，以拟南芥、山核桃、杨树的AUX/IAA 蛋白质序列作为参考，在MEGA11 软件中进行系统发育树的构建，研究核桃AUX/IAA蛋白与拟南芥、山核桃、杨树AUX/IAA蛋白之间的进化关系，通过1000个重复的引导分析评估树的拓扑支持度，系统发育树显示的引导值大于50。
1.2.4 基因结构、蛋白基序与保守结构域分析 使用在线网站GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）绘制基因结构图。通过MEME11（http：//memesuite.org/meme/tools/meme）获得JrAUX/IAA 的蛋白基序。 通过Pfam search（http：//pfam.xfam.org/search）对成员结构域的保守性进行研究，并使用TBtools 对获取的motif 和domain 结果进行可视化分析。
1.2.5 核桃AUX/IAA 基因启动子顺式作用元件分析 利用TBtools 软件提取JrAUX/IAA 基因上游2000 bp 的启动子序列，将其提交到Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站进行顺式作用元件预测，通过手动整理后采用TBtools软件进行可视化分析。
1.2.6 蛋白互作预测与共线性分析 以拟南芥作为参考，利用在线网站STRING（https：//string-db.org/）分析AUX/IAA的蛋白互作网络，选定模式植物拟南芥为物种参数，去除不成簇和单个节点的蛋白得到蛋白互作网络图。使用TBtools进行JrAUX/IAAs物种内共线性分析及核桃与拟南芥、杨树，山核桃物种间共线性分析，选取基因前2000 bp序列分析顺式作用元件，使用TBtools软件进行可视化分析。
1.2.7 基因表达分析 转录组数据库由深圳微科盟科技集团有限公司完成，对转录组数据进行分析从而获取JrAUX/IAAs 基因在内果皮的表达水平FPKM 值，分析获得核桃AUX/IAA 基因在木质部的表达模式，并进行热图绘制。
参考基因组（.fasta）链接：
https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/001/411/555/GCF_001411555.2_Walnut_2.0/GCF_001411555.2_Walnut_2.0_genomic.fna.gz.
gtf/gff注释文件链接：
https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/001/411/555/GCF_001411555.2_Walnut_2.0/GCF_001411555.2_Walnut_2.0_genomic.gff.gz.
1.2.8 qRT-PCR验证 从转录组中筛选出可能参与核桃内果皮中木质素生物合成的24 个高表达JrAUX/IAA 基因和8 个木质素沉积的差异表达基因进行实时荧光定量PCR分析，引物由北京擎科生物科技股份有限公司（西安）合成（表2）。以18S 作为内参基因，引物序列为F：GGGCTTTGCCCGTTGCTCTG，R：TAATTTGCGCGCCTGCTGCC。使用PerfectStart Green qPCR SuperMix试剂盒，在Quantstudio5 仪中进行，每个反应设置3 次重复。根据2-△△CT法计算目的基因的相对表达量[30]。
表2 qRT-PCR 引物信息
Table 2 Primers used for qRT-PCR analysis
基因名称Gene name JrAUX26 JrAUX2 JrAUX27 JrAUX48 JrAUX16 JrAUX20 JrAUX34 JrAUX57 JrAUX51 JrAUX19 JrAUX40 JrAUX39 JrAUX6 JrAUX52 JrAUX62 JrAUX35 JrAUX38 JrAUX56 JrAUX30 JrAUX23 JrAUX61 JrAUX8 JrAUX59 JrAUX28 JrCCR Jr4CL JrCOMT JrHCT JrPAL JrC4H JrCAD JrPOD正向引物序列Forward primer ATTGCCCGGGAGTGATGGGC TCCGCGGCCAAGAACGAAGT GCTCTGGGCAGAGAGGTGCT AGCCACCAGCGCGTACTTGA AGGCCCGCATGTCAGCCAAT CGGCGCCGGAGGTGGAAATAA ACCGTGCCTCGAACGCTTCC GGGGAAATGGAAAGCAAGGTGGC CAAGGCAGCCTCCGACTCAG CCATGAGTTGCGTGGTGAGC AGACCTGCATGGGGTGGAGT TGACTGTGATCCAGGGCAGTG CCCTCAGAGATCAGGCTGGC CGCAGATCACTCTGCACCCG TGGGAGTGGTGGATCCGAGG TCTGACACGAGCACGCATGG ACAGGTGACAAAATCCCCTAAGC TCCGGCAGTAGTCGCCTCTT TGGAACTCTGGGCAGGGAGG AGGTGGCCTGGTTCAGAATGG AGGTTGCCAGTCGAACACCG CTTAAGGCTGCCGGGCGAGA GTCAAGTTGTGGGGTGGCCT GAGCTGCGAGCCTGAGACTG CGAGACTCCCTCTGCGTCTGGA AGAGTGGTGTTGTCTGGGGCG GGCGTCTCTGACGGAATCCCA GACCTGGTGGTACCGCGCTT CAATGGCAACGGCAACGGCA TTTTGGGAGCACGAAGGCCAC GTGCTTGGCTGCGTCGTGTT AGCCTTTGCTCCCAGCTTTTGC反向引物序列Reverse primer TGCCTTGGCTGGAGGCTCAC TGCTCACGCTGCCCTTCTCG CACGGCCCTTGGAGCTAGGC TCTCCAACCAGCATCCAATCTCCA CGCCAGCGGACCCTGGTTAT TGTGCCTTGGATGGGTGTTTTGC TTCTCCAGCCCTACTGCCCGA TCCCTGCGTGTGGAGCATCA TGCCCGTCTCACACCAACAC GCTTGCCCACTTGGAGCACT CGAGGCCTTGCAGCTCTTCT GCCTCCTACAGGAGTCGGTGA GCATAGTCATCGCAGCCGGT ACTGAGGCAGGCATTCGGTG GCTGCAGGAGCAGAGAGCTG TCCGGTTGTCAGCAAGTGGC TCCTTTCTTGAAATCTTGGAGCTGG CCGGCCAACGATAACCCCAT CCTGCACTTCTCTACGGCCC ACTGGAAAACCCGGGCACTG TGGTTTCCAGCAGGGCAAGA GTGGCCACCCCACTATCTGC TCAACGCCTCGCTGATACCG CACTGGTGGCCAACCCACAA TGCTCCACCGGGGTGAACTCT TGTGCCGCATGAGCCTGACT GGTGGTGGGCATCTTTGCCA GAAGAGCACACCCTCGGCGT CTTGCCCCCGAGCAGGACAA ACAAGTTCCGCAAGCCCCCA CCGGCACATAGAAGCGGTGC TCGCAGCCCTGGACAAAGCA
2 结果与分析
2.1 JrAUX/IAAs基因家族的鉴定
根据本课题组构建的核桃基因组数据库（https：//walnut.ac.cn/WalnutGDB/），利用隐马尔可夫模型（HMM）和blast 求交集的形式，对核桃数据库中的AUX/IAA候选基因序列逐个进行分析、比对，共获得核桃AUX/IAA 基因63 个候选基因序列。对鉴定出的63 个AUX/IAA 基因家族候选基因进行理化性质分析，根据其在染色体上的分布位置依次命名为JrAUX/IAA1～JrAUX/IAA63（表3）。核桃AUX/IAA蛋白的氨基酸数量介于90～1296 之间；等电点（pI）介于4.79～10.47 之间；分子质量介于10.24～144.92 kDa 之间，20 个JrAUX 等电点大于7，偏碱性，其余均小于7，偏酸性；根据不稳定系数越大、蛋白质越稳定的原则，最不稳定的蛋白质是JrAUX4（32.84），最稳定的是JrAUX19（71.05）。所有家族成员均为亲水性蛋白，亚细胞定位预测结果显示，47 个JrAUX/IAA 定位于细胞核，12 个定位于叶绿体，4 个定位于细胞质（JrAUX4/13/40/63）。
?
?
2.2 JrAUX/IAA 基因家族中核桃与其他植物的系统发育关系
为了进一步确定核桃与其他模式作物的进化关系，选择222 个AUX/IAA 蛋白质序列，其中包括25个拟南芥蛋白质序列、63 个核桃蛋白质序列、59 个山核桃蛋白序列和75 个杨树蛋白序列构建系统发育树。基于核桃全参考基因组63 个AUX/IAA 基因组成员对进化树进行分类（图1），NJ 系统发育树显示，JrAUX/IAA 基因可分为4 组，命名为亚家族Ⅰ～Ⅳ，同一家族内成员亲缘关系较近，超过一半的JrAUX/IAA 家族蛋白质聚类在Ⅳ组中，共有39 个，而Ⅰ和Ⅱ亚组中分别含有8 和16 个JrAUX/IAA 蛋白质；Ⅲ亚组中不含JrAUX/IAA蛋白质。进化树分析结果表明，核桃与杨树和山核桃皆具有极高的同源性，这可能与其皆为同源植物有关；近一半AtAUX/IAA 蛋白（16 个成员）在进化过程中保留了保守性，因此核桃与拟南芥的亲缘关系较远。
图1 核桃与拟南芥、山核桃、杨树AUX/IAA 基因蛋白家族进化分析
Fig.1 Comparative evolutionary analysis of AUX/IAA gene families in Juglans regia and related woody angiosperms
Jr.核桃；At.拟南芥；PO.杨树；PE.山核桃。
Jr.Juglans regia;AT.Arabidopsis thaliana;PO.Populus trichocarpa;PE.Carya cathayensis Sarg.
2.3 JrAUX/IAA基因的染色体定位
通过分析核桃JrAUX/IAA基因在染色体上的分布状况，发现63 个JrAUX/IAA 基因不均匀地定位到16 条染色体上（图2）。其中，Chr7 含有数量最多的JrAUX/IAA 成员（9 个），其次是含8 个成员的Chr1，Chr4、Chr3 和Chr8 均含有7 个成员。含JrAUX/IAA成员最少的染色体为Chr15和Chr16，均仅含有1个JrAUX/IAA 基因。值得注意的是，最长的染色体Chr1 含有8 个JrAUX/IAA 成员，约占总基因数的12.7%。此外，同一染色体上的基因在进化树中大多属于不同的亚族，因此推测同一染色体上的不同基因可能行使不同的功能。
图2 JrAUX/IAA 基因的染色体分布
Fig.2 Chromosomal distribution of JrAUX/IAA genes in Juglans regia
框中的颜色代表核桃中染色体的基因密度。
The colors in the boxes represent the gene density of chromosomes in walnuts.
2.4 JrAUX/IAAs 基因结构、蛋白基序及保守结构域分析
为明确JrAUX/IAA 的基因结构，对获得的63 个核桃AUX/IAA 基因的候选基因序列进行分析，将核桃AUX/IAA基因家族的基因结构根据进化树聚类分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组。此外，还分析了JrAUX/IAAs 基因的内含子/外显子结构，可以清楚地看到，同一亚家族中的基因具有相似的基因结构。而不同亚家族之间的基因结构存在明显差异，结果表明，Ⅰ组中有18 个JrAUX/IAA 基因含有4 个内含子，有12 个基因含有3 个内含子，只有JrAUX/IAA45 含有2 个内含子，Ⅱ组中JrAUX/IAA63 未鉴定出内含子，其中JrAUX/IAA4 和JrAUX/IAA19 分别含有1 个和3 个内含子，Ⅲ组中所有基因都具有多个内含子，其中JrAUX/IAA24 含有16 个内含子，而JrAUX/IAA21 和JrAUX/IAA32 仅含有2 个内含子（图3-A），推测5 个外显子、4个内含子是该基因的主要结构模式；同一亚族的JrAUX/IAA转录因子的基因结构相对保守。
图3 JrAUX 的预测保守基序（A）和基因结构（B）
Fig.3 The predicted conserved motifs(A)and gene structure(B)of JrAUX
基因结构的多样性促进了基因家族的进化，通过MEME 软件来确定JrAUX/IAA 蛋白序列的保守基序，以便深入探索核桃JrAUX/IAA蛋白基序的相似性和多样性（图3-B）。结果显示，共鉴定出了15个比较保守的motif（分别命名为Motif 1～15），通过进化树分类分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，其中，Ⅰ组中鉴定出6 个JrAUX/IAA 保守基序，分别为motif14、motif7、motif11、motif 1、motif 2 和motif 8，而Ⅱ组中鉴定出motif 1和motif 8两条保守序列，Ⅲ组中鉴定出12个JrAUX/IAA 保守基序。综上所述，鉴定出motif 1、motif 2、motif 8 最为保守，稳定性较高，是所有组别的共有基序。而大多数JrAUX/IAA蛋白都具有motif7、motif11、motif14 基序，说明鉴定出的基因保守序列具有一定特异性。
保守结构域分析表明，63 个JrAUX/IAA 基因被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，其中包含高度保守的锌结合基序和NADPH 结合位点。共鉴定出3 个JrAUX/IAA 家族的结构域，分别为AUX/IAA family、B3 DNA binding domain和Auxin response factor结构域（图4），其中，Ⅰ组中所有JrAUX/IAA 家族成员仅有AUX/IAA family 结构域，而该结构域在JrAUX/IAA 家族中占比达到85%，Ⅱ组中只有JrAUX/IAA4 基因含有AUX/IAA family，其他2 个基因未发现结构域，而在Ⅲ组中全部基因都包含B3 DNA binding domain 和Auxin response factor结构域，大部分基因包含AUX/IAA family结构域。
图4 JrAUX/IAAs 的保守结构域分析
Fig.4 Conserved domain analysis of JrAUX/IAA protein
2.5 JrAUX/IAA基因的顺式作用元件分析
顺式作用元件在一定程度上可以反映基因的转录调控作用，通过PlantCARE web 工具预测起始密码子上游2000 bp 序列中的顺式作用元件，并利用TBtools 软件进行可视化分析。核桃AUX/IAA 家族成员启动子区域的顺式作用元件如图5 所示，依据其功能可以将这些顺式作用元件分为四大类，分别是与生长和发育调节相关的响应元件、激素响应元件、植物光响应元件和胁迫响应元件，表明核桃AUX/IAAs基因家族成员可能在植物激素调控、生长发育、光响应以及应对环境胁迫方面发挥作用。
图5 JrAUX/IAAs 启动子顺式作用元件预测
Fig.5 Prediction of cis-acting elements in JrAUX/IAA promoter regions
2.6 JrAUX/IAA蛋白互作网络预测与共线性分析
为了进一步探究物种的进化机制，笔者利用TBtools中的MCScanX程序对63个JrAUX/IAA基因的复制事件进行了分析，共鉴定出13个片段重复基因。种内共线性分析（图6）表明，16 条染色体中Chr7 与Chr8 彼此间共线性最强，chr1、chr2、chr3、chr4、chr11、chr12、chr16 中含有较多的片段重复基因，其他染色体中无JrAUX/IAA 片段复制基因，JrAUX/IAA 在进化过程中存在串联重复和片段重复。共检测到2 个串联重复事件，分别为JrAUX26和JrAUX34在3号染色体上串联；JrAUX63/27/60/16在7号染色体上串联。此外，还检测到3个片段重复事件，分别为JrAUX10 和JrAUX18、JrAUX5 和JrAUX42、JrAUX2和JrAUX55。
图6 核桃AUX/IAA 基因家族序列相似性分析
Fig.6 Sequence similarity analysis of the AUX/IAA gene family in walnut(Juglans regia)
为了进一步探索JrAUX/IAA基因在不同物种间的进化关系，对拟南芥（Arabidopsisthaliana）、杨树（Populus trichocarpa）和山核桃（Carya cathayensis）进行种间共线性分析（图7）。结果显示，核桃与拟南芥、杨树和山核桃3 种植物间均表现出共线性关系，并分别具有56、86 和157 个有共线性关系的JrAUX/IAA 基因，其中，仅4 个JrAUX/IAA 基因（JrAUX6、JrAUX10、JrAUX15 和JrAUX16）在拟南芥、核桃和杨树中不同时具有同源关系。
图7 拟南芥、杨树、山核桃和核桃AUX/IAA 基因的共线性分析
Fig.7 Colinearity analysis of AUX/IAA genes in Arabidopsis thaliana,Populus trichocarpa,Carya cathayensis,and Juglans regia
AT-拟南芥；PO-杨树；PE-山核桃。
AT-Arabidopsis thaliana;PO-Populus trichocarpa;PE-Carya cathayensis.
为了研究JrAUX/IAA基因家族蛋白间的相互作用，通过鉴定JrAUX/IAA 基因家族蛋白中的关键蛋白，笔者根据核桃AUX/IAA 蛋白与拟南芥中AUX/IAA 的同源蛋白的关系，构建了JrAUX/IAA 蛋白的相互作用网络（图8）。结果显示，在PPI网络中共识别出17 个节点和76 个组，AUX/IAA 与植物激素信号转导通路相关，2 个JrAUX/IAA 蛋白（JrIAA2、JrIAA27）可能为该网络中的关键节点。此外，存在AUX/IAA与ARF间相互作用，表明各转录因子间存在通过构成调控网络来发挥调控作用的事实。
图8 核桃AUX/IAA 基因家族的蛋白网络相互作用
Fig.8 Protein-protein interaction network of the AUX/IAA gene family in Juglans regia
线的颜色表示不同数据源，蛋白质用网络节点表示，边代表蛋白质的关联，红球代表生长素激活的信号通路，蓝球代表植物激素信号转导的途径，绿球代表亚细胞定位在细胞核中，黑线代表共表达。
The color of the line represents different data sources. Proteins are represented by network nodes, and edges represent the association of proteins.Red balls represent the signal pathway activated by auxin, blue balls represents the pathway of plant hormone signal transduction, green balls represent the subcellular localization in the nucleus,and black lines represent co-expression.
2.7 JrAUX/IAAs的表达模式分析
在露仁核桃中鉴定出63个AUX/IAA基因后，为了探究JrAUX/IAAs的表达模式，对其不同激素处理下的核桃果实硬化过程的2个发育时期的内果皮转录组数据进行分析，将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组，随着核桃内果皮的发育，肉质态逐渐向着壳质态发育，最后逐渐消失。结果显示，Ⅰ组中鉴别出的基因从T1时期至T2时期表达量整体上呈现降低的趋势，只有在I3 浓度处理下表达量呈现上升的趋势，其中，JrAUX51 和JrAUX19 的表达量上升极明显，Ⅱ组中鉴别出的基因经T1～T2 时期不同IAA 浓度处理下，除了I3 浓度处理后表达量呈上升趋势外，其他3 个浓度下基因表达量均呈现出下降的趋势，而通过NPA处理后的基因表达量从T1～T2时期呈现出降低的趋势。Ⅲ组中鉴定出的基因经T1～T2时期不同浓度IAA/NPA处理下表达量均呈现出上升的趋势，其中经I2浓度处理后的JrAUX23、JrAUX61和JrAUX8以及经I4 浓度处理后的JrAUX22、JrAUX27 和JrAUX2 表达量明显升高。Ⅳ组中经T1～T2 时期不同IAA 浓度处理下，仅JrAUX59 和JrAUX28 的表达量在I4浓度下表现出明显升高，而经T1～T2时期不同NPA 浓度处理下，JrAUX63 和JrAUX4 的表达量在N3 浓度下表现出明显降低的趋势，JrAUX20 和JrAUX21的表达量在N3浓度呈现出上升的趋势（图9）。以上结果表明这些JrAUX/IAA基因在激素胁迫中发挥重要作用。值得注意的是，JrAUX51、JrAUX19、JrAUX23、JrAUX61、JrAUX8、JrAUX22、JrAUX27、JrAUX2、JrAUX59、JrAUX28 基因表达水平较高且激素处理后明显上调表达，表明这些基因在核桃内果皮发育中极为关键。
图9 核桃AUX/IAA 基因家族成员在内果皮发育过程中的表达模式
Fig.9 Expression patterns of walnut AUX/IAA gene family members during endocarp development
T1.6 月15 日；T2.6 月27 日；I.IAA，N.NAA；CK（空白）、I1（50 mg·L-1）、I2（100 mg·L-1）、I3（150 mg·L-1）、I4（200 mg·L-1）、N1（50 mg·L-1）、N2（100 mg·L-1）、N3（150 mg·L-1）、N4（200 mg·L-1）。
T1.06-15;T2.06-27;CK represents blank;I1-I4 represent 50,100,150,200 mg·L-1 auxin,respectively;N1-N4 represent 50,100,150,200 mg·L-1 auxin inhibitor,respectively.
2.8 qRT-PCR验证
为了进一步验证JrAUX/IAA基因在核桃不同发育时期不同激素处理下的相对表达量，以花后50 d肉质态（T1）为对照（图10），对核桃不同发育时期喷施不同浓度的生长素及其抑制剂，经T1～T2时期不同浓度的IAA处理后，75%的JrAUX/IAA基因在从肉质态向壳质态转变的过程中呈现不同程度的上调表达，其中经I3处理的JrAUX2和经I4处理的JrAUX27上调表达极为明显，分别达到对照的50.67 和89.95倍，推测JrAUX2和JrAUX27是影响核桃内果皮发育过程中木质素合成的关键基因，且可以推测出IAA具有促进核桃内果皮中木质素沉积的作用。此外，经T1～T2 时期不同浓度的NPA 处理后，98%的JrAUX/IAA基因在从肉质态向壳质态转变的过程中呈现出不同程度的下调表达，其中经N4处理的JrAUX16下调表达差异最为明显，达到对照的89.74 倍，因此推测NPA具有抑制核桃中木质素沉积的作用。
图10 核桃内果皮不同发育时期不同激素浓度处理JrAUX/IAA 基因的qRT-PCR 分析
Fig.10 qRT-PCR analysis of JrAUX/IAA expression in Juglans regia endocarp across developmental stages
A.肉质态不同浓度生长素处理后的表达量；B.肉质态不同浓度生长素抑制剂处理后的表达量；C.壳质态不同浓度生长素处理后的表达量；D.壳质态不同浓度生长素抑制剂处理后的表达量。
A. JrAux/IAA expression levels under auxin treatments at varying concentrations in pulpy-hue pericarp. B. Expression under auxin inhibitor treatments in pulpy-hue pericarp.C.Expression under auxin treatments in scleritic-hue endocarp.D.Expression under auxin inhibitor treatments in scleritic-hue endocarp.
2.9 核桃木质素沉积基因在不同浓度生长素处理下的差异表达分析
以不同浓度不同激素处理下的生长素及其抑制剂为材料，对木质素合成通路上的差异表达基因进行实时定量qRT-PCR分析。如图11所示，木质素合成通路上的差异表达基因在经T1～T2 时期生长素（IAA）处理后，木质素沉积相关基因的表达量整体上呈升高趋势，经生长素抑制剂（NPA）处理后其基因表达量在T1 时期整体呈升高趋势，而在T2 时期不同基因的表达模式存在差异，其中JrCCR、JrC4H、JrPOD、JrCAD 呈下降趋势，表明生长素可能参与调控木质素合成通路上相关基因的表达。
3 讨 论
生长素是一种在低浓度时促进植物生长发育的有机物质，调节植物的许多发育过程，包括细胞的扩张、根的起始、维管组织的分化、芽和花的生长；生长素也是控制根生长、根向地性和维管分化的主要植物激素之一[31]。此外，生长素还在指定的维管干细胞[32]和调节维管形成层[33]的活性方面起着至关重要的作用，维管形成层是树木次生径侧向生长的分生组织。对树木形成层组织中生长素水平的测定揭示了一个径向的生长素浓度梯度，高浓度生长素分布在形成层，中浓度生长素分布在木质部伸长区，而低浓度生长素分布在成熟区[34-36]。
AUX/IAA基因是木质素合成过程中的关键基因之一，为了进一步探究激素与核桃内果皮硬化之间的关系，笔者利用基因结构、保守基序、物种间的共线性、顺式作用元件等生物信息学方法探究基因所隐藏的生物学功能。在本研究中共鉴定了63 个JrAUX/IAA 家族基因，其中，与大豆（Glycine max）[37]中鉴定的数量一致，而与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中29 个AUX/IAA 基因[38]，以及水稻（Oryza sativa）中31 个AUX/IAA 基因[39]的数量存在差异，对JrAUX/IAA 的基因结构进行分析，发现所有的JrAUX/IAA 皆含有保守的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。这与拟南芥、水稻和大豆中的研究结果一致[38-40]，推测JrAUX/IAA基因在植物生长发育中的功能具有高度保守性，理化性质分析发现，核桃JrAUX/IAA基因家族所有成员均为亲水性蛋白，蛋白质的高亲水性使蛋白质可以代替细胞中的水分子，从而更好抵御干旱胁迫对植物造成的损伤[40]，其中69%呈酸性，推测其可能在酸性亚细胞环境中发挥作用，亚细胞定位预测表明，核桃JrAUX/IAA 基因主要在细胞核中表达，推测该家族在细胞核信号转导中发挥重要作用，这与Lu等[41]的研究结果一致。
对启动子区顺式作用元件进行预测分析，可以推断下游基因编码蛋白可能具备的功能，且位于启动子上的大量顺式作用元件可以通过与特定的转录因子结合，从而调控基因的表达[42]，启动子分析结果显示，核桃AUX/IAA 基因家族成员激素响应元件极为丰富，且数量巨大，还有大量可能响应低温、光照、干旱、盐胁迫、高温等作用元件。而在拟南芥中也有许多激素参与调控花的开放或形成，如赤霉酸能诱导植物在低温下开花，控制花的形成[43-44]，茉莉酸通过上调SlMYB21 在番茄中的表达促进花朵开放和花器官发育[45]，在核桃中可能也有类似功能。在基因表达分析中，启动子区含有激素、干旱、高温以及盐胁迫响应元件的成员，JrAUX2和JrAUX27在不同激素处理下明显被诱导；与鱼尚奇等[7]的研究结果基本一致，Rademacher 等[39]在拟南芥中发现AtIAA9和AtIAA16也参与次生细胞壁的形成和木质素的合成。为了进一步探究激素与基因的关系，通过qRTPCR分析，发现在经不同时期不同浓度IAA处理后，JrAUX2、JrAUX27 基因表现出明显高倍数表达，分别达到对照的50.67 和89.95 倍，这在一定程度上表明该家族基因表达与启动子预测结果较一致，而部分不含上述响应元件的成员在不同处理下也出现明显响应，说明基因在表达的同时可能受其他因素调控。AUX/IAA处理后的动态表达量表明，JrAUX/IAA基因家族成员参与了生长素调控，此外，拟南芥、龙眼和番茄的AUX/IAA基因家族成员对外源激素IAA的应用也有相应的反应，其明显的个体表达模式依赖于时间和浓度[46-48]。其中，JrAUX2 和JrAUX27 可能与木质素的合成密切相关，推测这2 个基因在核桃内果皮发育过程中对木质素合成的调控起关键作用。对木质素沉积基因在不同浓度生长素处理下进行差异表达分析，发现生长素可能参与调控木质素合成通路上相关基因的表达。这一发现为深入解析核桃内果皮发育的分子机制提供了重要线索。
本研究首次系统鉴定了核桃中的JrAUX/IAA基因家族成员，并揭示了JrAUX2和JrAUX27在核桃内果皮发育和木质素合成中的潜在作用。这些发现为今后进一步研究核桃AUX/IAA基因的功能奠定了重要基础，在此基础上分析处理后核桃木质素沉积、木质素含量及内源激素的变化，从而达到用最适浓度的外源激素控制核桃硬壳的硬度，制定合理的生产措施，为辅助选育高品质薄壳核桃新品种提供理论依据。
4 结 论
在本研究中鉴定出63 个JrAUX/IAA 基因，并对其进行了基因结构、染色体定位、基因相似性及在核桃不同时期不同浓度下的表达模式分析。发现其不均匀地分布在16条染色体上，亚细胞定位预测分析表明，其主要定位于细胞核。系统发育将AUX/IAA家族成员分为4 个亚族，各亚族内的基因结构和保守基序相似。共线性分析发现，AUX/IAA 家族有2对串联重复基因和3 对片段重复基因，通过对鉴定出的63 个基因进行表达模式分析并结合qRT-PCR分析，推测JrAUX2、JrAUX27 可能是影响核桃内果皮发育过程中木质素合成的关键基因，并对木质素沉积基因在不同浓度生长素处理下进行差异表达分析，发现生长素可能参与调控木质素合成通路上相关基因的表达。本研究结果为今后进一步研究核桃AUX/IAA 基因的功能奠定了基础，并为明确核桃内果皮发育的调控基因提供了参考。
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