新会陈皮由茶枝柑果皮（Citrus reticulata‘Chachi’）炮制而成，具有理气健脾、燥湿化痰等功效，是食药两用药材的典型代表，广泛应用于中医临床和日常保健[1]。茶枝柑炮制品依传统药用分类，可根据果实发育阶段将其分为个青皮（GQP）、四花青皮（SHQP）与陈皮（CRP），三者在化学成分和药理活性上存在显著差异[2-3]。具体而言，花后45 d和105 d是萜类等挥发性物质合成与转化的关键起始阶段，而花后195 d则代表挥发性成分谱趋于稳定、特征香气成分形成的成熟阶段[4-5]。这3 个时期分别代表幼果、未成熟果和成熟果阶段，涵盖了挥发性物质合成与积累的关键转变期，与挥发性有机物（VOCs）的组成和含量密切相关[6-7]。作为主要挥发性物质，萜类化合物主要通过MEP 途径合成[8]。其中，D-柠檬烯、γ-萜品烯等单萜以及N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯等特征成分[9]，不仅是香气的主要来源[10]，也与抗氧化、抗菌等生物活性密切相关[11]。
近年来，已有研究对茶枝柑挥发性物质进行了初步解析。例如，Liu等[5]采用HS-GC-IMS技术结合PLS-DA 对7—12 月果皮挥发性物质的动态变化进行分析，构建了指纹图谱并鉴定出12 种差异标志物。部分研究侧重于不同采收期黄酮类成分的变化或干燥方式对挥发性物质的影响[10，12]。然而，现有研究多集中于化学成分的定性定量描述，对于VOCs积累的分子调控机制，尤其是转录因子（TFs）如何调控萜类合成关键基因的表达，仍缺乏系统探索。尽管有研究表明，萜类生物合成及其转录调控已有系统阐述[13]，但对于茶枝柑这一特定药用资源，尤其在3个具有明确传统药用价值与化学转变意义的关键采收期背景下，目前仍缺乏将VOCs 的动态变化与其生物合成基因表达及上游转录调控网络进行整合的系统研究。
因此，本研究在已有化学分析的基础上，整合GC-MS 挥发性物质检测与转录组测序数据，通过WGCNA 共表达分析、转录因子预测与调控网络构建，系统解析了3 个采收期茶枝柑果皮挥发性物质的变化规律，并深入挖掘调控萜类合成的关键基因及其上游转录因子。本研究不仅从分子层面阐明挥发性物质积累的转录调控机制，也为高品质茶枝柑的定向育种和陈皮的质量控制提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料及样品处理
2023年，在广东省江门市新会区林业科学研究所资源圃，随机选择4株树龄为6年且长势一致的健康植株（红柠檬作为砧木）进行采样（即每时期n=4株生物学重复），采样时期以传统药用分类为依据，最终选定3个关键发育阶段，分别为花后45 d（用于炮制传统药用分类的GQP）、105 d（用于炮制传统药用分类的SHQP）和195 d（用于炮制传统药用分类的CRP）。从每株树的东、南、西、北4 个方向各采摘2个大小均匀、健康的果实。果实采摘后，立即剥离果肉，将果皮置于液氮中速冻，随后转移至-80 ℃超低温冰箱保存，用于后续分析。
1.2 茶枝柑果皮中挥发性物质的提取
将新鲜果皮于液氮中研磨成粉末过100 目筛后，称取0.1 g 于2 mL 离心管中，加入500 μL 去离子水涡旋混匀，再加入500 μL提取液（含0.02%壬酸甲酯的甲基叔丁基醚溶液）涡旋混匀，冰水浴超声40 min，离心10 min（12 000 r·min-1，4 ℃），取上清液，经0.22 μm 滤膜过滤后转移至进样瓶，备注样品信息，随后上机检测，未能及时检测的样品则于-20 ℃冰箱保存。
1.3 气相色谱-质谱联用检测
GC-MS数据处理与分析流程如下：原始数据经Analysis Base File Converter 软件格式转换后，导入MS-DIAL 进行解卷积处理，获取各组分详细信息。化合物定性分析通过Mass Hunter软件结合NIST17谱库完成（匹配相似度＞85%）。随后，对每个样本的峰信号强度进行分段与归一化处理，去除冗余信号后构建数据矩阵。
将该矩阵导入R 语言环境进行多元统计分析。首先进行主成分分析（PCA），以评估样本整体分布及分析过程稳定性。进一步采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）与正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）对不同采收期样本进行区分。为防止模型过拟合，采用7折交叉验证与200次响应置换检验对模型进行验证，并基于OPLS-DA模型计算变量投影重要性（VIP值）。最后，结合VIP＞1.0与双尾t检验（P＜0.05）筛选组间差异显著的代谢物。
标准曲线制备：配制不同浓度（ρ，后同）（10、25、50、100、250、500、1000 μg·mL-1）的α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、γ-萜品烯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯标准品，按上述条件检测，对不同浓度组分峰面积进行积分，利用内标（壬酸甲酯）校正后，绘制浓度与校正后峰面积的线性曲线，用于定量分析。
1.4 转录组测序和分析
转录组测序委托上海欧易生物医学科技有限公司完成。首先，提取样品总RNA 并构建文库，使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库进行质检，合格后利用Illumina HiSeqTM 2500 测序仪进行PE150 双端测序。测序数据以克里曼丁橘基因组（JZ v1.0，http：//citrus.hzau.edu.cn）为参考进行比对与注释。使用fastQC v0.11.5 和RseQC 2.6.4 进行原始数据质量评估；使用HISAT2 v2.2.1.0 将高质量序列比对至参考基因组；使用StringTie v1.3.3b进行转录本组装与表达量定量分析（以FPKM 表示）。在此基础上，筛选满足｜log2FoldChange｜＞1 且校正后P＜0.05 的基因作为差异表达基因（DEGs）。
进一步采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对转录组数据进行挖掘。将表达模式相似的基因聚类为不同模块，通过计算模块特征值（MM）与基因显著性（GS）筛选每个模块中的核心基因（Hub genes），筛选条件为MM＞0.9 且|GS|＞0.8。相关分析在欧易云平台（https：//cloud.oebiotech.com/）完成。为鉴定关键基因的调控因子，以皮尔逊相关系数r＞0.8 为标准，筛选与目标基因表达高度相关的转录因子，并通过比对拟南芥基因组数据库（TAIR10）进行注释。
1.5 数据处理与分析
采用Excel 2010（Microsoft，USA）软件进行数据预处理，结果以平均值±标准误（M±SE）表示。采用SPSS（IBM SPSS Statistics，USA）软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并采用Benjamini-Hochberg（BH）校正P 值。通过SIMCA-P14.1（Umetrics，Sweden）进行多元统计分析，采用欧易作图平 台（https：//cloud.oebiotech.cn/task/）、Origin2021、Cytoscape（v3.5.1）和TBtools等软件进行可视化分析[13-14]。
2 结果与分析
2.1 不同时期茶枝柑果皮中挥发性物质分析
采用GC-MS 技术对GQP、SHQP、CRP 三个关键采收期茶枝柑果皮的挥发性物质进行系统检测。首先，通过总离子流色谱图（TIC）评估样品分离效果，结果显示：3 个时期样品的色谱峰分离度良好，无明显重叠，且信号强度呈现CRP（7.80×106）＞GQP（4.80×106）＞SHQP（3.60×106）的趋势（图1），表明检测方法可有效捕获不同时期的成分差异。为实现目标成分的准确定性与定量分析，对6 种核心香气成分（α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、γ-萜品烯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯）的标准品混合样品进行GC-MS检测，结果显示所有目标成分均实现有效分离，峰形对称清晰，无干扰峰（图2），可作为后续定性分析依据。进一步构建标准曲线，6 种成分的相关系数（r）介于0.988 8～0.998 2之间，线性关系良好（表1），可满足定量分析的准确性要求。
表1 6 个标准品的线性回归方程
Table 1 Linear regression equations for the six standard samples
标准品Standard sample α-蒎烯α-Pinene β-蒎烯β-Pinene β-月桂烯β-Myrcene D-柠檬烯D-Limonene γ-萜品烯γ-Terpinene N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯Benzoic acid,2-(methylamino)-,methyl ester回归方程Equation of linear regression y＝0.018 1x-0.804 5 y＝0.008 0x-0.317 4 y＝0.003 0x-0.328 3 y＝0.006 1x-0.147 2 y＝0.014 6x-0.613 0 y＝0.016 6x-1.176 9相关系数Correlation coefficient，r 0.988 8 0.991 0 0.998 2 0.995 3 0.996 3 0.995 5线性范围Linearity range/（μg·mL-1）50～500 50～500 50～1000 10～750 50～500 50～1000
图1 GQP、SHQP 和CRP 时期样品的总离子流色谱图（TIC）
Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)of samples from the GQP,SHQP and CRP Periods
图2 6 种主要的香气成分在果皮样品及标准品混合样品中的检测结果
Fig.2 Detection of six major aroma compounds in peel samples and mixed standard samples
1.α-蒎烯；2.β-蒎烯；3.β-月桂烯；4.D-柠檬烯；5.γ-萜品烯；6.壬酸甲酯（内标）；7.N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯。
1.α-Pinene;2.β-Pinene;3.β-Myrcene;4.D-Limonene;5.γ-Terpinene;6.Methyl nonanoate(internal standard);7.Benzoic acid,2-(methylamino)-,methyl ester.
基于上述可靠的检测方法，本研究共鉴定出30种挥发性物质，分为7类（表2）：萜烯类（16种）、醇类（5种）、醛类（4种）、酯类（2种）、醚类（1种）、酚类（1种）和生物碱类（1 种），其中萜类化合物为主要组成。果皮中挥发性物质含量随着果实生长发育而变化，其中23 种挥发性物质如α-蒎烯、β-蒎烯、γ-萜品烯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯含量在GQP 时期最高，至CRP时期逐渐降至最低；而D-柠檬烯、β-月桂烯、癸醛、(+)-香茅醛、α-荜澄茄油烯等8种物质含量则随着果实成熟而持续增加（图3）。
表2 茶枝柑果皮挥发性物质的鉴定与分类
Table 2 Identification and classification of volatile compounds in C.reticulata‘Chachi’peel
分类Category萜烯类Terpenes CAS 28634-89-1 80-56-8 555-10-2 18172-67-3 123-35-3 99-83-2 29050-33-7 535-77-3 5989-27-5 99-85-4 586-62-9 17699-14-8 157477-72-0 242794-76-9化学结构式chemical formula物质名称Compound name 2-崖柏烯2-Carbapenem α-蒎烯α-Pinene β-水芹烯β-Phellandrene β-蒎烯β-Pinene β-月桂烯β-Myrcene α-水芹烯α-Phellandrene(+)-4-蒈烯(+)-4-Carene M-伞花烃M-Cymene D-柠檬烯D-Limonene γ-萜品烯γ-Terpinene萜品油烯Terpinolene α-荜澄茄油烯α-Cubebene顺式-摩勒-4(15),5二烯Cis-muurola-4(15),5-diene 4,8,8-三甲基-2-亚甲基-4-乙烯基二环[5.2.0]壬烷Bicyclo[5.2.0]nonane,2-methylene-4,8,8-trimethyl-4-vinylα-法呢烯α-Farnesene 1-异丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,5,6-六氢萘1-isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,3,4,5,6-hexahydronaphthalene顺式-4-侧柏醇cis-4-Thujanol芳樟醇Linalool(+)-β-香茅醇(+)-β-Citronellol(-)-4-萜品醇(-)-Terpinen-4-ol α-松油醇α-Terpineol癸醛Decanal(+)-香茅醛(+)-Citronellal辛醛Octanal 3-己烯醛3-Hexenal 2-异丙基-5-甲基茴香醚Benzene,2-methoxy-4-methyl-1-(1-methylethyl)-麝香草酚Thymol 2-甲基-辛酸甲酯Methyl 2-methyloctanoate戊酸5-羟基-2,4-二叔丁基苯基酯Pentanoic acid,5-hydroxy-,2,4-di-t-butylphenyl esters N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯Benzoic acid,2-(methylamino)-,methyl ester C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H14 C10H16 C10H16 C10H16 C15H24 C15H24 C15H24 502-61-4 16729-00-3 C15H24 C15H24醇类Alcohols醛类Aldehydes醚类Ethers酚类Phenols酯类Esters 15537-55-0 78-70-6 1117-61-9 20126-76-5 98-55-5 112-31-2 2385-77-5 124-13-0 4440-65-7 1076-56-8 89-83-8 2177-86-8 166273-38-7 C10H18O C10H18O C10H20O C10H18O C10H18O C10H20O C10H18O C8H16O C6H10O C11H16O C10H14O C10H20O2 C19H30O3生物碱类Alkaloids 85-91-6 C9H11NO2
图3 基于GC-MS 的挥发性物质含量趋势变化热图
Fig.3 Heatmap of trend changes in volatile compound contents detected by GC-MS
各时期挥发性物质含量分析结果表明，GQP时期有11种挥发性物质相对含量超过0.8%，含量占比从高到低排序依次为γ-萜品烯（45.10%）、D-柠檬烯（26.70%）、α-蒎烯（6.10%）、β-蒎烯（4.70%）、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯（4.30%）、β-侧柏烯（2.90%）、β-月桂烯（2.00%）、萜品油烯（1.70%）、间伞花烃（1.50%）、麝香草酚（1.40%）和(+)-4-蒈烯（1.10%）；SHQP时期减少至9种，较GQP时期缺失麝香草酚和(+)-4-蒈烯；而CRP时期仅8种，较SHQP时期缺少N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯（图4）。值得注意的是，γ-萜品烯与D-柠檬烯在各时期的相对含量占比总和均超过70%，是果皮的特征性主导成分；而新会陈皮的标志性成分N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯含量随着果实成熟而持续递减。
图4 GQP、SHQP 和CRP 三个时期样品挥发性物质含量占比
Fig.4 Proportions of volatile compounds in samples from GQP,SHQP and CRP periods
图中展示的是相对含量超过0.8%的物质。
The figure shows substances with a relative content above 0.8%.
2.2 挥发性物质的多元统计学分析
对GC-MS 鉴定的30 种挥发性物质进行多元统计分析（图5-A～B），结果显示PLS-DA模型（主成分PC1贡献率92.1%，PC2贡献率1.9%）实现了3个时期样本的清晰分离，且组内重复样本聚集性良好。为防止过拟合，采用7折交叉验证对模型进行评估，验证参数Q2值为0.97，表明模型具有优异的预测能力和稳定性。基于此模型，笔者筛选出6 种变量投影重要性（VIP）大于1.5的化合物，即α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、γ-萜品烯和N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯，作为区分3个采收期的潜在生物标志物。进一步的相关性分析表明，经Bonferroni多重检验校正后，上述标志物中α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、γ-萜品烯与N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯之间存在极强的正相关性（校正后P＜0.01，相关系数r＞0.9），而D-柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯与γ-萜品烯之间则呈显著负相关（校正后P＜0.01，r＜-0.8）。这一结果表明，α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、γ-萜品烯和N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯含量变化趋势具有一致性，而β-月桂烯含量变化趋势与之相反。外标法验证结果（图5-C）进一步证实，D-柠檬烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、β-蒎烯和N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯含量呈现GQP＞SHQP＞CRP 的递减趋势，而β-月桂烯含量变化趋势则完全相反。
图5 GC-MS 的多元统计学分析
Fig.5 Multivariate statistical analysis of GC-MS
A.PLS-DA 分析；B.PLS-DA 模型的交叉检验；C.6 种潜在的生物标记物外标法和内标法的趋势比较。
A. PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis); B. Cross-Validation of PLS-DA model; C. Trend comparison of external and internal standard methods for 6 potential biomarkers.
2.3 潜在生物标记物与转录组关联分析
对6 个潜在生物标志物与转录组数据进行加权基因共表达网络分析（Weighted Correlation Network Analysis，WGCNA）。根据代谢物变化模式与基因表达模式，转录组数据共聚类为7 个模块（图6-A）。其中，MEblue 模块基因数量最多（2350 个），其次为MEcyan 模块（1316 个）和MEdarkred 模块（824 个）（图6-B）。鉴于单萜类物质是决定茶枝柑果皮挥发性物质品质的关键成分，本研究重点分析了各模块中与萜类生物合成相关的基因，发现仅3个核心基因定位于萜类骨架合成通路，分别为牻牛儿基焦磷酸合酶（GPPS，Ciclev10008936m）、1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶（HDS，Ciclev10027881m）和（E）-4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶（HDR，Ciclev10029878m）。通过全基因组及拟南芥基因组数据库比对，共鉴定到31 个与HDS 通路相关的转录因子，7 个与HDR 通路相关的转录因子，而GPPS 通路相关转录因子最少（2 个）。值得注意的是，3 个转录因子（Ciclev10007882m、Ciclev10015354m 和Ciclev10001893m）在HDS 与HDR通路中均存在（表3，图6-C）。
表3 GPPS、HDS 和HDR 基因相关调控因子的注释
Table 3 Annotations of regulatory factors associated with GPPS,HDS and HDR Genes
基因名称Gene name HDS HDR GPPS基因ID Gene ID Ciclev10000881m Ciclev10001956m Ciclev10000654m Ciclev10020130m Ciclev10016982m Ciclev10032029m Ciclev10000593m Ciclev10019585m Ciclev10016427m Ciclev10025963m Ciclev10001376m Ciclev10020263m Ciclev10009593m Ciclev10007882m Ciclev10001893m Ciclev10032076m Ciclev10011554m Ciclev10028259m Ciclev10012263m Ciclev10018691m Ciclev10015354m Ciclev10021278m Ciclev10026013m Ciclev10015413m Ciclev10005658m Ciclev10019533m Ciclev10001979m Ciclev10032039m Ciclev10020053m Ciclev10002089m Ciclev10015049m Ciclev10007737m Ciclev10015266m Ciclev10001893m Ciclev10009761m Ciclev10007882m Ciclev10015354m Ciclev10000608m Ciclev10026105m Ciclev10008836m拟南芥同源基因ID A.thaliana ID AT4G33280 AT1G01720 AT2G38470 AT1G18330 AT1G28360 AT2G40340 AT1G76880 AT2G20180 AT4G18960 AT4G36730 AT4G14770 AT1G06070 AT5G25190 AT4G26640 AT3G56850 AT2G40620 AT5G17300 AT2G28550 AT3G09600 AT1G09770 AT2G01930 AT5G62940 AT4G40060 AT4G18880 AT3G24050 AT5G04410 AT5G67300 AT3G55370 AT4G00050 AT5G45580 AT2G04880 AT4G29000 AT2G20570 AT3G56850 AT5G26170 AT4G26640 AT2G01930 AT3G20770 AT1G80840 AT4G31550 P值P-value 1E-16 2E-89 1E-124 5E-19 6E-52 2E-59 1E-165 2E-90 3E-88 1E-126 3E-89 1E-171 1E-82 4E-97 3E-84 1E-120 4E-73 1E-130 1E-126 0 1E-115 3E-67 9E-80 4E-83 4E-56 1E-40 2E-94 3E-74 1E-104 8E-84 4E-91 1E-151 1E-81 3E-84 5E-52 4E-97 1E-115 0 9E-62 1E-100基因注释Gene description B3 家族蛋白B3family protein NAC 家族蛋白NAC family protein WRKY DNA 结合蛋33 WRKY DNA-binding protein 33 MYB相关家族蛋白MYB_related family protein ERF结构域蛋白12 ERF domain protein 12 ERF 家族蛋白ERF family protein三螺旋家族蛋白Trihelix family protein光敏色素互作因子3-样蛋白5 Phytochrome interacting factor 3-like 5 MIKC型MADS-box家族蛋白MIKC_MADS family protein G-box结合因子1 G-box binding factor1 TSO1样CXC2结构域TESMIN/TSO1-like CXC2 bZIP家族蛋白bZIP family protein ERF家族蛋白ERF family protein WRKY家族蛋白WRKY family protein ABA响应元件结合蛋白3 ABA-responsive element binding protein 3 bZIP家族蛋白bZIP family protein MYB相关家族蛋白MYB_related family protein AP2.7相关蛋白related to AP2.7 MYB相关家族蛋白MYB_related family protein细胞分裂周期蛋白5 Cell division cycle 5碱性五半胱氨酸蛋白1 Basic penta cysteine1 Dof家族蛋白Dof family protein同源异形盒蛋白16 Homeobox protein 16热激转录因子A4A Heat shock transcription factor A4A GATA 转录因子1 GATA transcription factor 1 NAC结构域蛋白2 NAC domain containing protein 2 MYB结构域蛋白R1MYB domain protein R1 OBF结合蛋白3 OBF-binding protein 3 bHLH 家族蛋白bHLH family protein G2样家族蛋白G2-like family protein锌依赖性激活蛋白1 zinc-dependent activator protein-1 TSO1样CXC结构域蛋白Tesmin/TSO1-like CXC domain-containing protein GBF富含脯氨酸区互作因子1 GBF' spro-rich region-interacting factor1 ABA响应元件结合蛋白3 ABA-responsive element binding protein3 WRKY DNA结合蛋白50 WRKY DNA-binding protein50 WRKY 家族蛋白WRKY family protein碱性五半胱氨酸1样蛋白Basicpentacysteine1家族蛋白（乙烯不敏感3样蛋白）EIL family protein WRKY DNA 结合蛋白40（WRKY40）WRKY DNA-binding protein 40 WRKY DNA 结合蛋白11（WRKY11）WRKY DNA-binding protein 11
图6 潜在生物标记物和转录组进行加权共表达网络分析（WGCNA）
Fig.6 Weighted Correlation Network Analysis(WGCNA)of Potential Biomarkers and Transcriptome
A.基于加权基因共表达网络分析（WGCNA）的基因聚类树状图；B.表型与模块之间的相关性和差异性；C.HDS、HDR 和GPPS 的网络关联图，红色模块代表正相关的转录因子，绿色模块代表负相关的转录因子。
A.Gene clustering dendrogram from weighted gene co-expression network analysis(WGCNA);B.Heatmap of correlations between co-expression modules and phenotypic traits;C.Network Correlation Diagram for HDS,HDR,and GPPS.red modules represent positively correlated transcription factors,and green modules represent negatively correlated transcription factors.
为了直观揭示关键转录因子对萜类合成通路的调控关系，笔者构建了核心转录因子与靶基因的共表达调控网络（图7）。该网络清晰地呈现了一个多层次、级联式的调控模型。其中，转录因子WRKY20被鉴定为核心调控枢纽，直接作用于萜类骨架合成途径中的关键酶基因HDS 与HDR；与此同时，上游合成基因DXPS与GPPS也整合于调控网络之中，共同接受上游信号的协调调控。该调控级联最终精准地指向了主要萜类终产物D-柠檬烯与γ-萜品烯的合成与积累。此网络模型系统地阐明了从转录因子启动、靶基因响应到最终产物合成的完整调控链条，为解析茶枝柑果皮挥发性萜类物质积累的分子机制提供了直观的框架。
图7 基于WGCNA 的茶枝柑果皮萜类合成关键基因共表达调控网络
Fig.7 Co-expression regulatory network of key terpenoid biosynthesis genes in the peel of Citrus reticulata‘Chachi’based on WGCNA
粗黑色实线箭头表示强共表达调控关系，中黑色实线箭头表示中等共表达调控关系，黑色虚线箭头表示代谢流指向关系。
Thick black solid arrows indicate strong co-expression regulatory relationships,medium black solid arrows represent moderate co-expression regulatory relationships,and black dashed arrows denote metabolic flow directions.
3 讨 论
本研究基于GC-MS 结合多元统计分析方法鉴定的6 个特征标志物（D-柠檬烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯），不仅能有效区分茶枝柑GQP、SHQP、CRP三个关键采收期[16-17]，其含量的动态变化更与陈皮“理气健脾、燥湿化痰”的药效物质基础直接相关[17]。其中，萜类化合物（尤其是D-柠檬烯）的抗氧化、抗菌等活性是陈皮发挥临床与保健功能的核心支撑[17-19]；而N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯作为新会陈皮的标志性物质[20]，其含量随成熟度而递减的趋势为陈皮的真伪鉴别与陈化年限评估提供了关键指标[17]，但其合成机制有待结合代谢流分析、关键酶基因功能验证等进一步阐明。
通过WGCNA共表达分析，笔者筛选出3个萜类合成途径关键基因（GPPS、HDS、HDR）及其共表达的37 个转录因子，其中Ciclev10007882m（WRKY20）、Ciclev10015354m（BPC1）和Ciclev10001893m（ABREBP3）为可能协同调控HDS 与HDR 表达的核心转录因子。在柑橘属中，WRKY 家族成员已被广泛报道参与萜类合成调控。研究显示，该家族成员与激素信号的协同作用可能是关键调控环节。在甜橙（Citrus sinensis）中鉴定到81个CsWRKYs，其启动子富含ABA 响应元件（ABRE）和JA 响应元件（CGTCA-motif）[21]；柑橘中萜类合成关键基因（如编码d-柠檬烯合成酶的CsTPS1）启动子也含有ABRE 及WRKY 转录因子的核心结合位点W-box[22]，这为WRKY与激素信号协同调控萜类合成提供了潜在的分子基础，也进一步印证了WRKY 家族在柑橘萜类合成调控中的核心作用。克里曼丁橘（Citrus clementina）中多个CcWRKY 成员也被证实参与次生代谢通路的调控[15]。本研究推测Ciclev10007882m（WRKY20）可能通过类似机制调控HDS、HDR表达，但仍需通过试验进一步验证其与靶基因启动子的直接结合能力。
上述转录调控网络的构建，不仅揭示了关键分子组分，更深层次阐释了其在茶枝柑不同发育阶段精准协调资源分配与适应性策略的分子机制。在幼果期，果皮组织较为幼嫩，物理防御能力尚未健全，此时高含量的γ-萜品烯、α-蒎烯等单萜类物质，可作为植物重要的抑菌素与拒食剂，帮助果实抵御病原菌的侵染和植食性昆虫的危害，建立关键的化学防御屏障[24-25]。该阶段萜类合成关键基因（如HDS、HDR）高表达，并与WRKY等胁迫响应型转录因子共表达，进一步从分子层面证实了幼果期代谢流倾向于合成防御性次生代谢产物[26-27]。随着果实发育进入成熟阶段，茶枝柑的生态策略由生存防御逐步转向种子传播，D-柠檬烯相对含量在此阶段占据主导地位。该变化具有双重生态适应意义：首先，D-柠檬烯作为高效抗氧化剂，能够维持成熟果皮细胞的氧化还原稳态，延缓组织衰老，从而为后期陈皮陈化过程中药效物质的保存提供结构基础。已有研究证实，在茶枝柑成熟果皮中，D-柠檬烯是挥发性物质的核心组成，其含量与果皮的整体抗氧化能力呈正相关，表明其在药效维持方面具有重要作用[28]。其次，D-柠檬烯具有强烈的特征性香气，是吸引动物取食以促进种子传播的关键嗅觉信号。柑橘属的相关研究表明，成熟果实中D-柠檬烯在挥发性萜类中的占比与种子成熟度呈同步上升趋势，推测其可能通过介导植物与动物间的互作关系，促进种子的远距离传播，这与柑橘类果实在生态适应中形成的普遍规律相符[28]。
4 结 论
本研究系统揭示了茶枝柑果皮在GQP、SHQP与CRP时期VOCs的动态变化规律，共鉴定出30种VOCs。其中，萜类化合物占主导地位，D-柠檬烯和γ-萜品烯为主要组分。6 种关键标志物（D-柠檬烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯和N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯）含量在不同采收期间差异显著，可作为区分不同成熟阶段的标志物。
在分子机制层面，本研究系统阐明了茶枝柑萜类生物合成的多层次调控网络。萜类骨架合成途径中3 个关键基因（GPPS、HDS 和HDR）的表达模式，与主要萜类标志物（如D-柠檬烯与γ-萜品烯）的动态积累高度相关。通过共表达网络分析，进一步筛选出37 个可能与上述关键基因协同表达的潜在转录因子。由GPPS、HDS 和HDR 及其上游转录因子构成的调控模块，是影响茶枝柑果皮萜类物质积累差异的关键分子基础，为后续的功能验证与调控网络解析提供了明确的方向与候选基因。
在应用层面，本研究为茶枝柑品质改良与陈皮质量调控提供了明确靶点与可行路径。一方面，WRKY20 可作为开发功能分子标记（如基于其启动子或编码区关键SNP/InDel的KASP标记）的核心靶点，用于辅助选育高含量萜类种质资源；另一方面，基于6 种关键标志物与近红外光谱技术，可实现对陈皮采收期的精准判定与真伪鉴别，为产业链标准化提供技术支撑。综上所述，本研究不仅深化了对茶枝柑挥发性物质合成调控机制的理论认识，也为药用柑橘资源的高值化利用提供了实践依据。
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