柑橘病毒类病害是指由病毒和类病毒等病原物侵染柑橘引起的一类病害，世界上已报道的此类病害有80余种，具有易传播扩散、常潜伏侵染、复合侵染率高、树体终生带毒、危害周期长和难以防治等特点[1-2]，而柑橘衰退病、柑橘碎叶病、柑橘裂皮病、温州蜜柑萎缩病、柑橘黄脉病等在中国发生较为普遍，其中尤以柑橘碎叶病危害严重。自1962 年首次在从中国引进到美国加州的北京柠檬上发现该病害以来[3]，目前已广泛分布在中国、美国、日本、澳大利亚和南非等多个柑橘主产国[4]。
浙江柑橘碎叶病最早于20 世纪70 年代由日本防疫所在从黄岩引进的本地早、乳橘、椪柑等品种上发现，80年代中期，张天淼等[5]通过指示植物鉴定出在黄岩栽培的本地早、槾橘、乳橘、早橘等10个品种感染柑橘碎叶病。90 年代初，谢佩华等[6]又在温州地区的柳橙、椪柑、四季柚等8个品种上检测到柑橘碎叶病。此后，陆续有关于浙江省柑橘碎叶病的研究报道。尽管如此，或是因为多数柑橘品种存在隐症现象、叶片黄化易与生理性病害相混淆、嫁接口处“肿大”症状常被视为砧穗不亲和等，柑橘碎叶病在生产中未引起人们足够的重视。近年来，随着红美人等优新杂柑品种的兴起，苗木的不规范化繁育和无序调运问题愈发突出，致使柑橘碎叶病呈加重蔓延的趋势，植株衰弱、枯死乃至大面积毁园的现象时有发生，已成为柑橘产业可持续发展的重要障碍。
柑橘碎叶病的病原物为柑橘碎叶病毒（citrus tatter leaf virus，CTLⅤ），是线性病毒科（Closteroviridae）发状病毒属（Capillovirus）的正义单链RNA 病毒。鉴于形态学、血清学和分子生物学特性上的密切相关性，CTLⅤ被认为是苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGⅤ）的一个株系，其基因组大小约6.5 kb，包含ORF1（6.3 kb）和ORF2（1.0 kb）两个重叠的开放阅读框，其中ORF1 编码一个分子质量为241 ku的多聚蛋白，外壳蛋白位于其C端，大小约为27 ku[7-8]。已有研究表明CTLⅤ不同分离物存在较丰富的遗传多样性[4，9-12]，其外壳蛋白基因序列在强、弱毒分离物之间存在差异[13]，但其与地理来源和寄主品种的相关性方面不同的研究结果不尽相同，对于浙江省不同产区和柑橘品种特别是红美人等杂柑品种上CTLⅤ的遗传变异尚未见有系统的研究报道。
笔者在本研究中通过持续多年的跟踪调查，明确柑橘碎叶病在浙江省的发生分布情况，并通过序列分析探究CTLⅤ的遗传多样性及其与地理来源和寄主的相关性，以期为进一步研究CTLⅤ的系统演化、致病性分化及开展对柑橘碎叶病的有效防控提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
植物材料：柑橘叶片样品多数采集于浙江台州、丽水、宁波、金华、温州、衢州、嘉兴、舟山、杭州和绍兴等地，少量采集于广东阳江、广西桂林、云南大理、云南红河、四川成都和上海崇明等地。柑橘品种包括红美人、媛小春、满头红、晴姬、091 无核沃柑、椪柑、甘平、由良温州蜜柑、宫川温州蜜柑、尾张温州蜜柑、佛手、春香、兴津60、黄美人、砂糖橘、四季柚、明日见、贡柑、茂谷柑、香水柠檬、甜橘柚和沃柑等。
主要试剂：总RNA 小量制备试剂盒AP-MNMS-RNA-250 和DNA 凝胶回收试剂盒AP-GX-250购自爱思进生物技术（杭州）有限公司，一步法RTPCR试剂盒PrimeScript™One Step RT-PCR Kit Ⅴer.2购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖品牌为西班牙Biowest，核酸染料GelRed为美国Biotium公司产品。
引物：对GenBank 中已登录的不同地理来源和寄主品种的柑橘碎叶病毒基因序列进行比对分析，选取保守区域设计用于扩增外壳蛋白基因全长的引物CTLⅤ-Fn（5'-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3'）和CTLⅤ- Rn（5'- AGAGTGGACAAACTCTAGAC-3'），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 病害调查与样品采集
2019—2022 年，持续在浙江省各柑橘产区调查柑橘碎叶病发生情况，观察并记录病害症状，从疑似病树上或随机选取的橘树上剪取带有3～5枚叶片的枝条，置于塑料自封袋中，带回实验室后立即处理或暂存于4 ℃冰箱中。
1.3 病原一步法RT-PCR检测
称取0.1 g柑橘叶片组织放入2 mL塑料研磨管中，置于冷冻研磨仪中在-49 ℃条件下将样品研磨粉碎，然后以总RNA 小量制备试剂盒提取样品总RNA，最后将制得的RNA 溶解在TE 缓冲液中备用。以样品总RNA 为模板，以特异性引物CTLⅤ-Fn/CTLⅤ-Rn进行一步法RT-PCR扩增，反应体系为：模板RNA 1 μL，2 × One Step Mix 25 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，引物CTLⅤ-Fn 0.5 μL，引物CTLⅤ-Rn 0.5 μL，无菌水20.5 μL，总体积50 μL。反应条件为：50 ℃30 min；94 ℃3 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环；72 ℃10 min。反应结束后，取反应产物上样于1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察并拍照。若样品泳道出现与阳性对照大小一致的条带，且阴性对照和空白对照无对应条带，则视为阳性；若样品泳道未出现与阳性对照大小一致的条带，且阴性对照和空白对照无对应条带，则视为阴性。
1.4 外壳蛋白基因测序分析
在紫外切胶仪中切取琼脂糖凝胶上的目的条带，以DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，然后送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。去掉测序结果5'末端和3'末端非编码区，仅保留完整的柑橘碎叶病毒外壳蛋白开放阅读框全长，然后用软件DNAstar中的MegaAlign程序对序列进行两两比对，分析不同分离物外壳蛋白基因核苷酸序列和氨基酸序列的相似率，并将序列信息登录到GenBank 中。用于系统发育分析的序列均从Gen-Bank 中下载，具体登录号为PP734420～PP734530，KP025652～KP025671，MH108975～MH108986，JX4-16228，MK481978，KY861873。包含在本研究中获得的相似率低于99%的所有序列，同一地理来源同一品种上相似率大于99%的多个序列则取其中之一，共111 个。从GenBank 中选取已登录的不同地理来源和柑橘品种的CTLⅤ外壳蛋白基因序列33个，及寄主种类为苹果的ASGⅤ外壳蛋白基因序列1 个。以发状病毒属的樱桃病毒A 为外群，利用MEGA5.05软件的邻接法构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 田间病害症状
对于已经显症的病树，柑橘碎叶病在不同柑橘品种上表现的病害症状大致相同，病树通常比健树生长缓慢，树势较弱，病树上的叶片初期呈现系统性轻微黄化，之后不断加重，至后期叶片严重黄化并陆续从树体上脱落，结果少甚至不结果，最后整个植株枯死。受强风或用手推拉等外力作用时，病树的砧穗接合处易断裂，且裂面光滑。在病树上靠接枸头橙等其他砧木，能在一定程度上增强树势，但叶片黄化、结果少、砧穗接合处易断裂等现象不能得到彻底改善，包括病树与靠接砧的结合部位也存在易断裂的情况（图1）。
图1 柑橘碎叶病的田间病害症状
Fig.1 Symptoms of citrus tatter leaf disease in the field
A.媛小春杂柑表现为叶片黄化、植株矮小；B.红美人杂柑表现为叶片严重黄化并脱落；C.砧穗结合部位易断裂且裂面光滑；D.原砧穗结合部位及靠接砧结合部位易断裂且裂面光滑；a.接穗；b.砧木；c.靠接砧。
A. Himekoharu shows leaf yellowing and plant stunting; B. Leaves of Ehime Kashi No. 28 shows severe yellowing and abscission; C. The graft union is prone to breakage and the crack surface is smooth;D.The graft union and inarching junction are prone to breakage and the crack surface is smooth;a.Scion;b.Rootstock;c.Inarched rootstock.
2.2 病害发生分布
对采集的951 份柑橘样品进行检测，结果显示有311 份样品感染柑橘碎叶病，阳性检出率为32.70%。从地域上来看，除湖州地区外，柑橘碎叶病已广泛分布在浙江省各柑橘产区（图2），病原物检测阳性率6.52%～57.14%不等（表1），其中尤以绍兴地区和宁波地区阳性检出率最高，分别达57.14%和55.91%，其次为金华、温州和衢州等地区，阳性检出率分别为42.86%、38.02%和35.29%，而杭州地区阳性检出率最低，仅为6.52%。在同一地区内，不同县（市、区）之间的阳性检出率也存在明显差异，如在整体检出率为29.40%的台州地区，黄岩区和温岭市的检出率分别高达54.17%和43.01%，临海市则仅为14.97%，而三门县14个样品均表现为阴性。从品种上来看，在所检测的43 个柑橘品种（品系）中，有27个表现为阳性，其中柑橘属的枸橼类10个佛手样品和酸橙类2 个枸头橙样品的检测结果均为阳性，橘橙类杂柑的阳性率高达48.54%，显著高于橘柚类杂柑（12.33%）、柑类（16.54%）、橘类（16.22%）和柚类（13.85%），而葡萄柚类相对较低，仅为4.55%，而柠檬㰀檬类的4个样品、枳属的1个样品和金柑属的5个样品均表现为阴性。在同一大类中，不同柑橘品种（品系）的阳性率也存在明显差异，如在整体检出率为48.54%的橘橙类杂柑样品中，沃柑等4 个品种的样品均表现为阴性，甘平阳性率为6.25%，而金秋砂糖橘、明日见、红美人等9个品种的样品阳性率均在40%以上；在整体检出率为12.33%的橘柚类杂柑样品中，春香的检出率高达85.71%，而甜橘柚的检出率则仅为4.55%。
表1 浙江省11 个地级市43 个柑橘品种（品系）上的碎叶病发生率
Table 1 Incidence of citrus tatter leaf disease on 43 citrus varieties(strains)in 11 prefecture-level cities of Zhejiang Province
地区Region县（市、区）County(City,District)柑橘品种Citrus cultivars所属大类Types检测样品数Number of tested samples阳性样品数Number of positive samples阳性率Positive rate/%金华Jinhua金东区Jindong District永康市Yongkang City佛手Fingered Citron 枸橼类Citron 10 10 100.00 0.00 14.29橘类Tangerine柑类Mandarin 12 7兰溪市Lanxi City义乌市Yiwu City浦江县Pujiang County满头红Mantouhong宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin红美人Ehime Kashi No.28甘平Kanpei水晶柚Shuijingyou红宝石青柚Ruby Pummelo沃柑Orah红美人Ehime Kashi No.28橘橙类Tangor橘橙类Tangor柚类Pummelo柚类Pummelo橘橙类Tangor橘橙类Tangor 10 5 10 10.00 20.00 0.00 20.00 0.00 100.00金秋砂糖橘Jinqiushatangju明日见Asumi红美人Ehime Kashi No.28大雅柑Dayagan橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘橙类Tangor 5 1 4 8 4 4 4 0 1 1 1 0 1 0 4 8 4 4 2台州Taizhou合计Total黄岩区Huyangyan District 84 45 36 25红美人Ehime Kashi No.28枳壳Trifoliate Orange椪柑Ponkan宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin红美人Ehime Kashi No.28春香Haruka鸡尾葡萄柚Cocktail Grapefruit兴津60 Okitsu No.60 091无核沃柑091 Seedless Orah晴姬Harehime枸头橙Goutoucheng满头红Mantouhong由良温州蜜柑Yura Satsuma Mandarin金秋砂糖橘Jinqiushatangju宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin甘平Kanpei红美人Ehime Kashi No.28红美人Ehime Kashi No.28媛小春Himekoharu砂糖橘Shatangju宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin明日见Asumi米哈亚Mihaya玉环文旦Yuhuanwendan高橙Gaocheng橘橙类Tangor枳属Poncirus橘类Tangerine柑类Mandarin 1 2三门县Sanmen County温岭市Wenling City 14 0 1 0 100.00 100.00 100.00 50.00 42.86 55.56 0.00 50.00 0.00 18橘橙类Tangor橘柚类Tangelo葡萄柚类Grapefruit橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘橙类Tangor酸橙类Sour Orange橘类Tangerine柑类Mandarin橘橙类Tangor柑类Mandarin 57 4 11 5 5 5 2 1 2 1 4 1 5 2 4 2 1 2 1临海市Linhai City 129 19 31.58 100.00 9.09 100.00 40.00 80.00 100.00 100.00 100.00 100.00 14.73天台县Tiantai County橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘类Tangerine柑类Mandarin 4 14 7 29 0 3 1 15 0.00 21.43 14.29 51.72 0.00 0.00 7 3 2 2玉环市Yuhuan City合计Total橘橙类Tangor橘橙类Tangor柚类Pummelo葡萄柚类Grapefruit 10 2 364 0 0 0 0 3 0 107 0.00 0.00 30.00 0.00 29.40
表1 （续） Table 1 (Continued)
地区Region县（市、区）County(City,District)柑橘品种Citrus cultivars所属大类Types检测样品数Number of tested samples阳性样品数Number of positive samples阳性率Positive rate/%丽水Lishui莲都区Liandu District红美人Ehime Kashi No.28瓯柑Ougan椪柑Ponkan甜橘柚Sweet Spring Tangelo沙田柚Shatianyou脆蜜金柑Cuimi Kumquat春香Haruka白肉琯溪蜜柚Bairouguanximiyou红肉琯溪蜜柚Hongrouguanximiyou宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin媛小春Himekoharu红美人Ehime Kashi No.28橘橙类Tangor柑类Mandarin橘类Tangerine橘柚类Tangelo柚类Pummelo金柑属Fortunella橘柚类Tangelo柚类Pummelo柚类Pummelo柑类Mandarin 23 15 7 2 3 5 4 2 2 4 10 65.22 14.29 0.00 0.00 0.00 0.00 50.00 0.00 0.00 10.00遂昌县Suichang County庆元县Qingyuan County合计Total象山县Xiangshan County橘橙类Tangor橘橙类Tangor 2 4 100.00 0.00甜橘柚Sweet Spring Tangelo 橘柚类Tangelo 58 1 0 0 0 0 1 0 0 1 2 0 3 5.17宁波Ningbo红美人Ehime Kashi No.28明日见Asumi黄美人Ehime Kashi No.68爱媛43 Ehime Kashi No.43尾张温州蜜柑Owari Satsuma Mandarin晴姬Harehime由良温州蜜柑Yura Satsuma Mandarin红美人Ehime Kashi No.28橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘橙类Tangor橘橙类Tangor柑类Mandarin橘橙类Tangor柑类Mandarin橘橙类Tangor 126 84 23 47 4 3 2 12 8 10 4 127 2 0 0 7 6 5 4 71温州Wenzhou宁海县Ninghai County合计Total龙港市Longgang City平阳县Pingyang County 5 7 8 37 0 7 3 1苍南县Cangnan County红肉琯溪蜜柚Hongrouguanximiyou红美人Ehime Kashi No.28砂糖橘Shatangju红美人Ehime Kashi No.28沃柑Orah麻步文旦Mabuwendan红肉琯溪蜜柚Hongrouguanximiyou明日见Asumi鸡尾葡萄柚Cocktail Grapefruit甘平Kanpei贡柑Gonggan茂谷柑Murcott甜橘柚Sweet Spring Tangelo四季柚Sijiyou红美人Ehime Kashi No.28柚类Pummelo橘橙类Tangor橘类Tangerine橘橙类Tangor橘橙类Tangor柚类Pummelo柚类Pummelo橘橙类Tangor葡萄柚类Grapefruit橘橙类Tangor柑类Mandarin橘橙类Tangor橘柚类Tangelo柚类Pummelo橘橙类Tangor 2 5 4 4 4 6 6 3 5 5 1 0 0 0 2 0 0 1 2 0 5合计Total衢江区Qujiang District 20 121 15 46衢州Quzhou柠檬Lemon 18.25 55.95 50.00 0.00 0.00 58.33 75.00 50.00 100.00 55.91 0.00 100.00 37.50 29.73 0.00 0.00 0.00 50.00 0.00 0.00 16.67 66.67 0.00 100.00 75.00 38.02 0.00红美人Ehime Kashi No.28宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin柠檬㰀檬类Lemon/Limonia橘橙类Tangor柑类Mandarin 4 2 3 0 1 0 50.00 0.00
表1 （续） Table 1 (Continued)
地区Region县（市、区）County(City,District)柑橘品种Citrus cultivars所属大类Types检测样品数Number of tested samples阳性样品数Number of positive samples阳性率Positive rate/%柯城区Kecheng District常山县Changshan County沃柑Orah由良温州蜜柑Yura Satsuma Mandarin椪柑Ponkan胡柚Huyou红美人Ehime Kashi No.28春香Haruka明日见Asumi红美人Ehime Kashi No.28宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin金秋砂糖橘Jinqiushatangju橘橙类Tangor柑类Mandarin橘类Tangerine葡萄柚类Grapefruit橘橙类Tangor橘柚类Tangelo橘橙类Tangor橘橙类Tangor柑类Mandarin 0.00 50.00 20.00 0.00 100.00 100.00 75.00 50.00 0.00开化县Kaihua County合计Total定海区Dinghai District橘橙类Tangor 1 2 5 4 1 1 4 2 2 3 0 1 1 0 1 1 3 1 0 3 100.00 34 12舟山Zhoushan红美人Ehime Kashi No.28上野温州蜜柑Ueno Satsuma Mandarin皋泄香柚Gaoxiexiangyou橘橙类Tangor柑类Mandarin柚类Pummelo 6 4嘉兴Jiaxing红美人Ehime Kashi No.28橘橙类Tangor合计Total南湖区Nanhu District海盐县Haiyan County合计Total建德市Jiande City 10 20 14 35.29 50.00 25.00 0.00 20.00 14.29红美人Ehime Kashi No.28橘橙类Tangor 4 75.00杭州Hangzhou宫川温州蜜柑Miyagawa Satsuma Mandarin红美人Ehime Kashi No.28柑类Mandarin 18 43 27.78 6.98橘橙类Tangor 3 46湖州Huzhou红美人Ehime Kashi No.28橘橙类Tangor 0.00 6.52 0.00绍兴Shaoxing合计Total南浔区Nanxun District合计Total诸暨市Zhuji City红美人Ehime Kashi No.28鸡尾葡萄柚Cocktail Grapefruit甘平Kanpei金橘Kumquat橘橙类Tangor葡萄柚类Grapefruit葡萄柚类Grapefruit金柑属Fortunella合计Total 4 4 4 1 1 1 7 3 1 0 4 2 3 5 3 0 3 0 0 4 0 0 0 4合计Total 951 311 0.00 100.00 0.00 0.00 0.00 57.14 32.70
图2 柑橘碎叶病在浙江省柑橘产区的分布情况
Fig.2 Distribution of citrus tatter leaf disease in citrus production areas of Zhejiang Province
2.3 CTLV外壳蛋白基因同源性分析
测序获得202 个CTLⅤ分离物的外壳蛋白基因序列，其核苷酸序列全长为714 个碱基。分析发现不同地理来源不同品种CTLⅤ分离物之间外壳蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分别为87.7%～100.0%和91.6%～100.0%，不同地理来源相同品种上CTLⅤ分离物之间外壳蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分别为87.7%～100.0%和92.0%～100.0%，同一地理来源不同品种上CTLⅤ分离物之间外壳蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分别为89.2%～100.0%和92.0%～100.0%，同一地理来源同一品种上CTLⅤ分离物之间外壳蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分别为88.8%～100.0%和92.0%～100.0%。此外，对单个样品测序图谱分析发现，有的分离物外壳蛋白基因序列中单个或多个碱基处呈现重叠峰，说明存在基因杂合的情况。相比较浙江省柑橘产区，来自云南、四川、广东、广西等柑橘产区同一地理来源同一品种上的分离物相对保守，序列相似率多为100.0%。
2.4 CTLV系统发育分析
基于CTLⅤ外壳蛋白基因序列构建的系统发育树如图3所示，在系统发育树上所有144个CTLⅤ分离物明显地分为两个大的分支，第一大分支包含98个CTLⅤ分离物，及ASGⅤ分离物Shaaxi-3；第二大分支包含46个CTLⅤ分离物。
图3 基于外壳蛋白基因序列构建的柑橘碎叶病毒的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of citrus tatter leaf virus constructed based on the sequence of coat protein gene
从地理来源以乡镇为单位来看，在来自浙江省36个不同乡镇的分离物中，有31个乡镇的分离物聚在第一大分支中，有21个乡镇的分离物聚在第二大分支中，其中16个乡镇的分离物在两大分支中均有分布；从地理来源以县（市、区）为单位来看，在来自浙江省17个不同县（市、区）的分离物中，有15个县（市、区）的分离物聚在第一大分支中，有10 个县（市、区）的分离物聚在第二大分支中，其中8 个县（市、区）的分离物在两大分支中均有分布；从地理来源以地级市为单位来看，第一大分支包含了来自浙江省所有8个地级市的分离物，第二大分支则包含6个地级市的分离物；从地理来源以省份为单位来看，笔者在本研究中获得的和GenBank 中登录的共10个省份的分离物均有在第一大分支中分布，其中浙江省的分离物有70个，第二大分支则包含7个省份的分离物，其中浙江省的分离物有32个。从地理来源以国家为单位来看，第一大分支包含中国的92个分离物、美国的5 个分离物和日本的2 个分离物，而第二大分支则仅包括来自中国的45 个分离物。第一个大分支中的98 个CTLⅤ分离物又分为7 个分支，浙江省的70 个分离物在每个分支中均有分布，其中台州市的32个分离物也广泛分布在其中的6个分支中，每个分支中包含2 个至多个来自不同省份的分离物，美国的5个分离物和日本的2个分离物与中国浙江、四川等地的6个分离物则聚为一个分支，而来自中国的分离物R40和TL112则与ASGⅤ分离物Shaanxi-3具有更近的亲缘关系，单独聚为一个分支。第二个大分支中的46个CTLⅤ分离物又分为5个分支，浙江省的32个分离物在每个分支中均有分布，其中台州市的15个分离物也广泛分布在其中的4个分支中，浙江台州临海市的3个分离物聚为一个分支，而浙江温州市苍南县分离物R43 则单独为一个分支，其他3 个分支中均包含来自不同省份的分离物。此外，每个分支下多包含2 个至多个小分支及更小的分支。
从寄主品种来看，在来自46个柑橘品种（品系）的分离物中，有36个品种（品系）的分离物聚在第一大分支中，有22个品种（品系）的分离物聚在第二大分支中，12个品种（品系）的分离物在两大分支中均有分布，其中数量最多的红美人品种上的分离物在两大分支中的分布数分别是36个和21个，而媛小春品种上的5个分离物和佛手品种上的4个分离物均全部聚在第一大分支中，2 个砂糖橘品种上的分离物均聚在第二大分支中。从柑橘品种（品系）所属大类来看，用于分析的所有10个柑橘大类的分离物在第一大分支中均有分布，第二大分支则包含其中的9 个大类，其中数量最多的橘橙类上的分离物在两大分支中的分布数分别是55个和26个，而酸橙类的2个分离物均聚在第一大分支中。在第一大分支下的7 个分支中，除四季柚上的分离物R40 和枸橼上的分离物TL112 与ASGⅤ分离物Shaanxi-3 聚为一个分支外，其他6个分支中均包含3个以上柑橘大类4 个以上柑橘品种（品系）的分离物，特别是第一分支中多达7个柑橘大类17个柑橘品种（品系）。橘橙类上的55 个分离物（其中红美人品种上36 个分离物）广泛分布在6个分支中，柑类温州蜜柑品种上的15 个分离物也在其中的4 个分支中均有分布，而橘橙类媛小春品种上的5个分离物和枸橼类佛手上的4个分离物分别集中聚在同一分支中。在第一分支下又分为2 个小的分支，其中一个小分支中包含来自11个品种（品系）的30个分离物，但其所属大类相对其他分支较为单一，除1个酸橙类分离物外，其余均为柑类和橘橙类。在第二大分支下的5 个分支中，除柚类四季柚品种上的分离物R43 单独聚为一个分支，柑类宫川温州蜜柑分离物SJ16R、XZ1R 与橘橙类红美人分离物SJ13R聚为一个分支外，其余3个分支均包含4个以上柑橘大类4个以上柑橘品种（品系）的分离物，其中最大的一个分支包含6 个柑橘大类12 个柑橘品种（品系）。橘橙类红美人品种的分离物在4 个分支中均有分布，柑类温州蜜柑品种（品系）也广泛分布在其中的3个分支中。
3 讨 论
多数柑橘品种感染CTLⅤ后通常不表现明显症状，但以枳及其杂种为砧木的柑橘植株被感染后会表现叶脉黄化、嫁接部位肿大易断裂、叶片易脱落、植株矮化乃至整株枯死等病害症状[4，14-15]。近年来研究发现，黄金蜜柚、三红柚、红肉琯溪蜜柚等品种感染CTLⅤ后还会表现新梢黄化、斑驳花叶等症状，在不知火品种上则会表现为新叶脉明症状，而在默科特、沃柑等品种上则会表现为果实变小、僵硬和不转色症状[12]。笔者在本研究中发现，以枳壳为砧木的红美人、媛小春等柑橘品种病害症状尤为严重，多表现为植株黄化矮小、叶片易脱落、砧穗结合处易断裂和整株枯死。新叶脉明症状虽也有在温州蜜柑等品种上被发现，但检测发现其同时携带CTLⅤ和柑橘黄化脉明病毒，因叶片脉明是柑橘黄脉病的典型症状，因此分析认为本研究中的新叶脉明症状系CYⅤCⅤ感染所致。此外，在CTLⅤ侵染的部分红美人植株上存在果实变小、僵硬等症状，但通过营养元素测定分析认为该症状或是由缺硼引起（相关数据待发表），是否与CTLⅤ侵染有相关性尚需进一步研究。
浙江省最早于20 世纪70 年代由日本防疫所在从黄岩引进的柑橘品种上发现柑橘碎叶病，之后相继在台州和温州地区检测到该病害[5-6]。近年来，项周等[10]利用PCR 技术对来自浙江省的10 份样品进行检测未发现其感染CTLⅤ，而高海馨等[12]则从浙江省46份样品中检出17份样品感染有CTLⅤ，阳性率高达36.96%。笔者在本研究中从来自浙江省全部11 个地级市的951 份样品中检测到10 个地级市的311 份样品感染有CTLⅤ，阳性率为32.70%，说明柑橘碎叶病已在浙江柑橘产区广泛分布。研究还发现浙江省不同地区及同一地区不同县（市、区）之间阳性率存在明显差异，如从国外引种较为活跃的象山县阳性率高达54.87%，而种植品种较为单一、引种和苗木调运频次较低的庆元县则仅为5.17%，因此认为从国外频繁引种和苗木无序调运可能是导致柑橘碎叶病发生蔓延的原因。
柑橘碎叶病在柑橘类植物上具有广泛的寄主，从20世纪60年代开始，人们陆续通过指示植物鉴定出北京柠檬、温州蜜柑、蕉柑等20 余个柑橘品种感染CTLⅤ[16]。20 世纪以来，通过PCR 或荧光定量PCR 技术检测到砂糖橘、沃柑、默科特等多个品种感染有CTLⅤ[17-19]，特别是高海馨等[12]从七大类55个柑橘品种中检测到了CTLⅤ。笔者在本研究中也从浙江省八大类26 个柑橘品种（品系）中检测到了CTLⅤ，包括温州蜜柑、椪柑等传统品种和红美人、媛小春等新兴的杂柑品种，说明该病害已在各柑橘品种中广泛分布。笔者在本研究中检测的枸橼类10个佛手样品均表现为阳性，与高海馨研究结果一致，不同的是笔者在本研究中发现橘橙类和橘柚类杂柑阳性率较高，达43.74%，而柚类阳性率仅有13.85%，特别是水晶柚、麻步文旦、皋泄香柚等地方特色品种均表现为阴性，这可能与该地区种植品种较为单一、鲜有外来苗木引入从而未导致碎叶病传播扩散有关。地区检出率的高低与其所种植的品种（品系）表现出一定的相关性，如种植橘橙类比例较高的宁波和绍兴地区较其他几个地区有更高的检出率，而湖州和嘉兴地区尽管所检测样品均为橘橙类红美人，但其检出率却为最低，这应该与该地区检测样品数量较少或所种植苗木多为无病毒苗木有关。
已有研究表明，CTLⅤ的CP 基因相对保守，但也存在着不同程度的遗传变异，核苷酸和氨基酸序列相似率为88.1%～100.0%和91.1%～100.0%不等，而这种变异与CTLⅤ的来源地域、寄主品种没有直接相关性[10，11，13]。笔者在本研究中对浙江省202 个CTLⅤ分离物的外壳蛋白基因分析发现，其核苷酸序列和氨基酸序列相似率分别为87.7%～100.0%和91.6%～100.0%，核苷酸序列最大变异超12%，其变异未表现出与地理来源和寄主品种明显的相关性，这与已报道的研究结果相似。有意思的是，笔者在本研究中发现CTLⅤ的CP 基因在有的样品中存在杂合的情况，且在不同样品中表现不尽一致，说明在自然条件下存在CTLⅤ不同株系混合侵染同一柑橘植株的现象，且其种群遗传结构会不断发生变化，这可能与带毒接穗在不同柑橘品种上被频繁高接有关，与刘科宏等[15]的研究发现相符合，即CTLⅤ接种不同柑橘品种后其CP基因核苷酸位点会发生变异，认为病毒株系在不同类型柑橘上的适应性存在差异，或是由于不同类型的柑橘在各自与病毒的共同演化过程中产生了不同的防御机制。
与高海馨等[12]通过CTLⅤ全基因组分析发现来自同一省份的CTLⅤ分离物多聚在相同的分支中不同，本研究中浙江省101 个分离物在系统发育树中广泛分布在不同的分支中，这与项周等[10]对湖北省分离物的分析结果和张金珠等[11]对广西分离物的分析结果相似。笔者在本研究中发现美国的5个分离物、日本的2个分离物与浙江和四川的6个分离物聚在同一个小的分支中，由此说明不同国家的CTLⅤ分离物呈现一定的地理相关性，这与张金珠等[11]的分析结果一致，也符合CTLⅤ起源于亚洲的论断和起源点病毒序列高度多样性的原则[4，20-21]。与高海馨等发现采自柚类的CTLⅤ分离物多聚在相同的分支中不同，在本研究中，柚类分离物多分布在不同的分支中，未呈现明显聚集的情况。其他柑橘大类分离物特别是橘橙类红美人品种上的分离物广泛分布在不同分支中，这可能与该品种在各柑橘产区推广种植及在各柑橘品种上广泛高接相关，符合CTLⅤ接种不同柑橘品种后其基因发生变异的研究结论[15]。橘橙类媛小春品种上的5个分离物和枸橼类佛手上的4个分离物分别集中聚在同一分支中，CTLⅤ是否在这两个品种上具有更高的保守性尚需要更多的分离物序列分析确定。此外，在本研究中，32 个浙江分离物与宋震等[13]报道的6个弱毒分离物聚在一大分支中，其余分离物与10个强毒分离物聚在另一大分支中，这些分离物是否存在致病性强弱差异尚有待进一步研究确定。
4 结 论
柑橘碎叶病在浙江柑橘产区发生普遍，广泛危害不同的柑橘品种（品系），其病原物种群存在丰富的遗传多样性，但其分化与地理隔离和寄主品种不存在明显的相关性。研究结果为进一步探究CTLⅤ的起源、系统演化和致病性分化奠定了基础，同时也揭示了规范化品种引进和苗木调运程序是预防该病害发生的关键。
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