樱桃(Cerasus pseudocerasus Lindl.)作为重要的经济果树,其花粉形态特征在品种鉴定、亲缘关系分析及遗传多样性研究中具有重要价值[1]。然而,不同樱桃品种花粉在大小、形状及外壁纹饰等方面的差异尚缺乏系统研究[2-3],尤其在高分辨率微观结构解析方面的研究存在不足。传统光学显微镜技术受分辨率限制,难以清晰揭示花粉表面的精细特征,而扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)技术以其高分辨率和立体成像优势,为花粉形态学研究提供了更精确的观察手段。前人已利用SEM技术对部分果树品种的花粉形态进行了观察,但在樱桃种质资源的系统性研究及分类鉴定方面仍有待深入[4]。笔者利用SEM 技术对17 份樱桃种质资源的花粉粒形态特征进行系统分析,利用相关性分析和聚类分析,全面揭示花粉形态的变异规律,以优化樱桃品种鉴定体系,揭示其微观结构特征,为品种鉴定及遗传分类提供科学依据。同时,也为丰富植物分类学与生殖生物学领域关于樱桃花粉形态的基础数据,以及樱桃种质资源保护与品种选育提供参考。
试验所用花粉均取自北京市农林科学院林业果树研究所通州樱桃育种基地,包括萨米特(Summit)、艳阳(Sunburst)、彩虹(Caihong)、雷尼(Rainier)、布鲁克斯(Brooks)、马什哈德(Mashad Black)、桑缇娜(Santina)、俄八(Russian 8)、罗亚明(Minie Royal)、罗亚李(Royal Lee)、秦林(Chelan)、卡塔琳(Katalin)、美早(Tieton)、7-2-9、7-5-30、对樱(Duiying)、兰丁1号(Landing 1)。
在樱桃盛花期(通常为4 月上中旬),在通州樱桃育种基地采集17 份樱桃种质资源含苞待放的花蕾。采集时间选在清晨至上午的温度适宜时段(大约08:00—10:00),以避免花粉在高温或强光下提前脱落。收集后,用小镊子轻轻地将花药完全剥取下来,避免破坏花粉粒。将花药置于干燥的硫酸纸盒中,放置于温度为18~22 ℃的室内避风环境中,用台灯(光源温度约为25 ℃)照射,促进花粉散发。花粉完全干燥后,将其小心收集至西林瓶中,塞上橡皮塞,贴好标签,标明采集时间和种质资源信息。最终,将收集到的花粉存放于-20 ℃冰箱中保存,以保持其活力和形态特征,为后续试验提供可靠的材料。
试验在中国农业科学院农产品加工研究所电镜室进行。先用棉棒蘸取干燥好的花粉粒样品,轻轻弹在硫酸纸上,再用剪裁好的1 cm×1 cm 双面导电胶带蘸取适量花粉,贴在金属载台上,放入Eiko IB5 Ion Coater离子溅射仪中镀金,最后置于日本日立公司SU-8010扫描电子显微镜下观察。花粉样品的观测:选取有代表性的视野,即在500×视野下对花粉粒群体状态拍摄,在1500×视野下对花粉粒个体形态拍摄。
首先调查17份樱桃种质资源的花粉整齐度,该指标用于评估花粉的生长状态,具体表现为花粉粒是否饱满、形态是否正常以及是否存在畸形或褶皱。高整齐度的花粉粒通常较为规则,而低整齐度的花粉粒则可能表现为不规则形状或形态不佳。利用扫描电子显微镜在500×视野下拍摄花粉粒群体状态照片,并观察记录花粉整齐度。利用Image J软件分别测量17 份樱桃种质资源花粉粒的极轴长(P)、赤道轴长(E)和极赤比(P/E)。每份种质资源设置5 次生物学重复,每次重复随机选取20 粒花粉。试验所得数据均使用SPSS 27.0 统计软件进行分析,采用Duncan 新复极差检验法进行显著性检验。花粉形状的分类方法及相关学术用语参照《孢粉学概论》[5]:极轴长和赤道轴长之比(P/E)表示花粉粒形状(P/E>2 表示花粉粒为超长球形,1.14<P/E≤2 表示花粉粒为长球形)。对17 份樱桃种质资源的花粉粒进行聚类分析,并对其花粉整齐度和极轴长度进行相关性分析。分别调查记录17 份樱桃种质资源的花粉粒形状和外壁纹饰的相关性状,即花粉粒外壁纹饰的条纹宽度、条纹间距、条纹倾斜度、条纹清晰度和花粉粒纹孔密度。
图1 统计了17 份樱桃种质资源的花粉整齐度。其中,兰丁1 号的花粉整齐度最高,为87.34%。对樱、艳阳、彩虹、马什哈德的花粉整齐度也较高,均在80%以上。其他樱桃种质资源(萨米特、雷尼、布鲁克斯、桑缇娜、俄八、罗亚明、罗亚李、7-2-9、7-5-30)较整齐,其花粉整齐度均在70%~80%之间。而秦林、卡塔琳、美早的花粉整齐度较低,分别为69.34%、50.04%、62.58%。综上所述,除秦林、卡塔琳和美早外,其他14份樱桃种质资源的花粉整齐度均较高,均在70%以上。
图1 17 份樱桃种质资源的花粉整齐度
Fig.1 Seventeen cherry germplasm resources'pollen uniformity
樱桃花粉粒通常呈长球形或超长球形,赤道面观多为椭圆形,三条萌发沟且呈环状分布,属于N3P4C5型花粉(图2)。通过扫描电子显微镜观察17份樱桃种质资源的花粉,发现其在极轴方向上具有三条萌发沟,延伸至花粉两端,且在极区未形成合沟。表1统计了17份樱桃种质资源的花粉粒形态大小,其极轴长度分布在41.53~48.57 μm,赤道轴长分布在21.30~25.29 μm,极赤比分布在1.67~2.17。花粉粒极轴长度可分为40~45 μm和45~50 μm两类,第一类包括雷尼、桑缇娜、罗亚李、秦林、卡特琳、美早、7-5-30和兰丁1号,第二类包括萨米特、艳阳、彩虹、布鲁克斯、马什哈德、俄八、罗亚明、7-2-9、对樱。其中,7-2-9的极轴长度最大,为48.57 μm;美早的极轴长度最小,为41.53 μm。分析结果显示,17 份樱桃种质资源中部分品种的赤道轴长度存在显著差异。此外,通过计算17 份樱桃种质资源的极赤比发现,其花粉粒的外观形态均呈长球形或超长球形。其中,桑缇娜、罗亚明、卡塔琳、美早和7-5-30为1.14<P/E≤2(长球形),其他樱桃种质资源均为P/E>2(超长球形)。
表1 17 份樱桃种质资源花粉大小指标
Table 1 Pollen size indicators of seventeen cherry germplasm resources
注:Duncan 显著性检验,不同字母代表差异显著,p<0.05。
Note:Duncanps multiple test,different letter indicated the significant difference at p<0.05 level.
品种Cultivar萨米特Summit艳阳Sunburst彩虹Caihong雷尼Rainier布鲁克斯Brooks马什哈德Mashad Black桑缇娜Santina俄八Russian 8罗亚明Minie Royal罗亚李Royal Lee秦林Chelan卡塔琳Katalin美早Tieton 7-2-9 7-5-30对樱Duiying兰丁1号Landing 1极轴长度Polar axis length/μm 45.31±3.82 c 45.95±3.19 bc 47.73±2.34 ab 44.76±2.14 c 45.95±3.38 ab 47.78±1.83 cd赤道轴长度Equatorial axis length/μm 22.29±2.59 cdef 22.33±1.66 cdef 22.99±2.15 bcde 22.04±1.88 cdef 22.99±1.49 bcde 22.64±1.43 cdef P/E Polar axis/Equatorial axis 2.06±0.28 ab 2.07±0.20 ab 2.09±0.22 ab 2.04±0.19 ab 2.01±0.22 abc 2.12±0.16 ab 1.85±0.30 c 2.05±0.25 ab 1.95±0.16 bc 2.07±0.24 ab 2.00±0.24 abc 1.95±0.26 bc 1.67±0.29 d 2.17±0.23 a 1.94±0.20 bc 2.06±0.19 ab 2.09±0.41 ab 44.46±4.01 bc 45.93±3.44 bc 45.85±1.61 cd 44.59±2.54 de 42.27±2.99 cd 43.89±3.78 e 41.53±4.02 c 48.57±2.49 a 44.62±2.74 cd 46.34±2.41 abc 44.42±5.89 cd 24.42±3.27 ab 22.61±1.86 cdef 23.60±1.41 bc 21.82±2.15 def 21.30±1.90 f 22.76±2.69 cdef 25.29±2.80 a 22.52±2.13 cdef 23.23±2.24 bcd 22.56±1.73 cdef 21.59±2.48 ef
图2 樱桃花粉赤道面观
Fig.2 Cherry pollen in equatorial view
根据花粉整齐度、极轴长度以及极赤比对17份樱桃种质资源进行聚类分析(图3)。根据花粉整齐度,可将17 份樱桃种质资源分为两个大类:第一大类为花粉整齐度>70%,第二大类为花粉整齐度≤70%。根据花粉整齐度和极赤比将第一大类又分为两个亚群。第一亚群为花粉整齐度>70%、P/E>2,包括罗亚李、兰丁1号、雷尼、7-2-9、对樱、俄八、马什哈德、布鲁克斯、彩虹、艳阳和萨米特;第二亚群为花粉整齐度>70%、1.14<P/E≤2,包括桑缇娜、7-5-30和罗亚明。第二大类花粉整齐度≤70%,包括卡特琳、美早和秦林,这3个樱桃种质资源的极轴长度均在40~45 μm。
图3 17 份樱桃种质资源的聚类分析
Fig.3 Seventeen cherry germplasm resources cluster analysis
对17 份樱桃种质资源的花粉整齐度与极轴长度进行相关性分析(表2,图4)。结果表明,花粉整齐度和极轴长度存在显著的相关关系,p<0.05,两者相关系数是0.271。由此可知,花粉整齐度与极轴长度之间存在较强的正相关关系。
表2 17 份樱桃种质资源花粉整齐度与极轴长度的相关性分析
Table 2 Correlation analysis of pollen uniformity and polar axis length in seventeen cherry germplasm resources
指标Index相关系数Correlation coefficient p花粉整齐度Pollen Uniformity极轴长度Polar axis length平均值±标准差Mean±standard deviation 76.01±9.02 45.29±1.83 0.271 0.032
图4 17 份樱桃种质资源花粉整齐度与极轴长度的相关性分析
Fig.4 Correlation analysis of pollen uniformity and polar axis length in seventeen cherry germplasm resources
对17 份樱桃种质资源花粉粒外壁纹饰的相关性状进行观察(图5)。结果表明,不同樱桃种质资源的花粉粒外壁纹饰的相关性状既有相似性也有差异性(表3)。萨米特、艳阳、彩虹、桑缇娜、俄八、秦林、美早、7-2-9、7-5-30和兰丁1号的条纹宽度较小;布鲁克斯、马什哈德、罗亚明、卡塔琳和对樱的条纹宽度适中;而罗亚李的条纹宽度较大。萨米特、艳阳、彩虹、雷尼、秦林、美早、7-5-30 和兰丁1 号的条纹间距小;布鲁克斯、马什哈德、桑缇娜、俄八、罗亚明、罗亚李、卡塔琳、7-2-9 和对樱的条纹间距适中。彩虹、桑缇娜、罗亚明、罗亚李、秦林、卡塔琳、美早和兰丁1号的条纹较平行;萨米特、雷尼、布鲁克斯、马什哈德、俄八、7-2-9、7-5-30和对樱的条纹稍有交叉;艳阳的条纹交叉最为明显。萨米特、艳阳、彩虹、雷尼、桑缇娜、俄八、秦林、美早、7-2-9、7-5-30和兰丁1号的条纹较为明显,而布鲁克斯、马什哈德、罗亚明、罗亚李、卡塔琳和对樱的条纹却非常明显。萨米特、艳阳、彩虹、雷尼、马什哈德、桑缇娜、俄八、罗亚明、罗亚李、秦林、美早、卡塔琳、7-2-9、7-5-30 和兰丁1号的纹孔密度小;布鲁克斯的纹孔密度较为适中;而对樱的纹孔密度较大。
表3 17 份樱桃种质资源花粉粒外壁纹饰相关性状
Table 3 Analysis of correlated traits of pouteran exine sculpture in seventeen cherry germplasm resources
品种Cultivar萨米特Summit艳阳Sunburst彩虹Caihong雷尼Rainier布鲁克斯Brooks马什哈德Mashad Black桑缇娜Santina俄八Russian 8罗亚明Minie Royal罗亚李Royal Lee秦林Chelan卡塔琳Katalin美早Tieton 7-2-9 7-2-9 7-5-30 7-5-30对樱Duiying兰丁1号Landing 1花粉粒形状Pollen shape超长球形Perprolate超长球形Perprolate超长球形Perprolate超长球形Perprolate超长球形Perprolate超长球形Perprolate长球形Prolate超长球形Perprolate长球形Prolate超长球形Perprolate超长球形Perprolate长球形Prolate长球形Prolate超长球形Perprolate长球形Prolate超长球形Perprolate超长球形Perprolate条纹宽度Stripe width小Small小Small小Small小Small适中Medium适中Medium小Small小Small适中Medium大Large小Small适中Medium小Small小Small小Small适中Medium小Small条纹间距Stripe spacing小Small小Small小Small小Small适中Medium适中Medium适中Medium适中Medium适中Medium适中Medium小Small适中Medium小Small适中Medium小Small适中Medium小Small条纹倾斜度Stripe slope稍有交叉Slightly crossed交叉Crossed平行Parallel稍有交叉Slightly crossed稍有交叉Slightly crossed稍有交叉Slightly crossed平行Parallel稍有交叉Slightly crossed平行Parallel平行Parallel平行Parallel平行Parallel平行Parallel稍有交叉Slightly crossed稍有交叉Slightly crossed稍有交叉Slightly crossed平行Parallel条纹清晰度Stripe clarity明显Ⅴisible明显Ⅴisible明显Ⅴisible明显Ⅴisible非常明显Ⅴery visible非常明显Ⅴery visible明显Ⅴisible明显Ⅴisible非常明显Ⅴery visible非常明显Ⅴery visible明显Ⅴisible非常明显Ⅴery visible明显Ⅴisible明显Ⅴisible明显Ⅴisible非常明显Ⅴery visible明显Ⅴisible纹孔密度Pixel density小Small小Small小Small小Small中Medium小Small小Small小Small小Small小Small小Small小Small小Small小Small小Small大Large小Small
图5 17 份樱桃种质资源的扫描电子显微镜花粉形态
Fig.5 Scanning Electron Microscopy(SEM)study of pollen morphology in seventeen cherry germplasm resources
1~3.萨米特;4~6.艳阳;7~9.彩虹;10~12.雷尼;13~15.布鲁克斯;16~18.马什哈德;19~21.桑缇娜;22~24.俄八;25~27.罗亚明;28~30.罗亚李;31~33.秦林;34~36.卡塔琳;37~39.美早;40~42.7-2-9;43~45.7-5-30;46~48.对樱;49~51.兰丁1 号。1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49 为花粉群体观察(500×);2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50 为花粉个体观察(1500×);3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51 为花粉个体观察(2250×)。
1,2,3.Summit;4,5,6.Sunburst;7,8,9.Caihong;10,11,12.Rainier;13,14,15.Brooks;16,17,18.Mashad Black;19,20,21.Santina;22,23,24.Russian 8;25,26,27.Minie Royal;28,29,30.Royal Lee;31,32,33.Chelan;34,35,36.Katalin;37,38,39.Tieton;40,41,42.7-2-9;43,44,45.7-5-30;46,47,48.Duiying;49,50,51.Landing 1.1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49 are images captured of pollen grain under 500×;2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50 are images captured of individual pollen grain under 1500×;3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51 are images captured of individual pollen grain under 2250×.
近年来,扫描电子显微镜技术因能清晰揭示花粉的形态特征而被广泛应用于多种植物,包括葫芦科[6]、核桃[7-8]、杨梅、苹果、榛子[9]、枸杞[10]、猕猴桃、枇杷属、番荔枝等。覃丽禄等[11]利用普通高真空扫描电镜在低电压条件下对不同种类的花粉进行了显微结构观察。但当花粉被花粉囊等其他物质覆盖时,其表面细节会变模糊,从而影响观察结果[12]。为解决这一问题,Ermolaev 等[13]通过HMDS 技术改进了扫描电镜花粉样本制备,大幅缩短了研究时间,提高了效率。这些技术不仅可以更清晰地观察花粉表面纹饰,还可以增强对花粉形态特征的理解,对植物分类和系统学研究意义重大。
花粉粒的形状和外壁纹饰[14]由于遗传上的稳定性,对植物分类和演化研究具有极其重要的价值[15]。这些特征不仅有助于鉴定植物的种类,而且对揭示植物间的亲缘关系也极为关键。Lindau通过综合分析花粉的形状、外壁纹饰和开孔数等性状,确定了花粉类型的范围,揭示了这些特征与物种间的联系,突出了它们在系统学研究中的重要性[16]。通过观察发现,供试17份樱桃种质资源的花粉整齐度和花粉粒形态表现出丰富的多样性。在花粉整齐度方面,大部分樱桃种质资源的花粉整齐度大于70%。在花粉粒形态方面,以花粉粒形状及外壁纹饰差异最为明显。有研究表明,较为原始的被子植物花粉体积较大,随着进化花粉体积趋向减小[17],花粉粒形状由长球形向超长球形演化。本试验中17份樱桃种质资源的花粉粒表面纹饰均为条纹状,除桑缇娜、罗亚明、卡塔琳、美早和7-5-30 为长球形之外,其他樱桃种质资源均为超长球形,说明大多数樱桃种质资源较为进化[18]。此外,花粉的形态特征与其活力之间也具有密切相关性。花粉表面纹饰的完整性及花粉壁的结构会影响花粉的萌发能力和生理活性,表面光滑、无缺陷的花粉通常具有较高的活力,因此花粉形态特征可以作为花粉活力的一个参考指标。扫描电子显微镜在樱桃分类和系统发育研究中发挥着关键作用。通过分析花粉粒的形态特征,可以有效区分樱桃种质资源,揭示它们之间的亲缘关系。这些特征的研究也有助于探索控制花粉形态的遗传机制,为遗传学研究提供基础。
在供试樱桃种质资源中,82.35%的种质资源花粉整齐度超过70%,70.59%的种质资源花粉粒形状为超长球形。花粉粒整齐度与极轴长呈正相关关系,外壁纹饰多为条纹状。尽管目前利用花粉粒形态对樱桃种质资源进行系统鉴定的研究较少,但本研究表明,花粉粒外壁纹饰的条纹宽度、间距、倾斜度及纹孔密度等特征在不同樱桃种质资源间存在显著差异,可作为种质资源鉴定的依据,但仍需深入研究。
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SEM observation of pollen in 17 cherry germplasm resources