新疆甜瓜种质资源遗传多样性及果肉硬度性状GWAS分析

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科二倍体植物（2n=2x=24），广泛栽培于全球，尤其在西方国家作为水果食用[1]。甜瓜富含维生素C、维生素A、钾和膳食纤维等营养成分，能保护心血管健康并促进消化。甜瓜含有约90%的水分，是天然的补水食物，同时具有抗氧化作用，有助于减少自由基损伤并延缓衰老。在传统医学中，甜瓜具有清热解毒、利尿等保健功效。甜瓜经济价值较高，尤其在中国新疆，是重要的生产基地。新疆甜瓜品种多样，哈密、吐鲁番、库尔勒和昌吉等地为甜瓜的主要种植区。近年来，甜瓜种植面积不断扩大，甜瓜产量占全国的三分之一。新疆甜瓜产业同质化、育种集中在少数亲本上、选育效率低等问题。对甜瓜种质资源进行遗传多样性分析，发掘重要性状基因位点可为制定遗传改良策略提供重要信息，促进品种多样性并提升市场竞争力。

甜瓜果实糖度、酸度、果肉颜色及硬度等是重要的品质特性，一直是遗传改良的关键研究领域。近年来，随着分子标记技术的发展，已经鉴定了许多与甜瓜品质相关的基因和数量性状位点（QTL），为提升甜瓜的市场品质和消费者接受度提供了理论基础和实践依据。Harel-Beja等[2]通过使用来自两个Cucumis melo L.亚种（野生亚种PI 414723和甜瓜亚种Dulce）的重组自交系群体，构建了一个富含果实性状的遗传图谱。该图谱鉴定了6个与果实糖含量（特别是主要影响甜度的蔗糖）相关的QTLs，以及3个与果实肉质颜色和类胡萝卜素含量相关的QTLs。Cohen等[3]基于Dulce（非酸性）和PI 414323（酸性）品种构建了重组自交系群体，鉴定了多个与pH、柠檬酸和苹果酸含量相关的QTLs。研究发现，一个与pH 相关的主要QTL与柠檬酸和苹果酸含量的QTL共定位，在这些QTLs中，酸性特性竟然来自非酸性亲本。

Sherman 等[4]结合大规模分离群体法与自主设计的微阵列技术，成功识别出与pH性状紧密相关的标记，且这些标记在所有种质资源中与pH性状显著关联。Cohen等[5]基于图位克隆的方法，从甜瓜中鉴定出一个对果实酸度有重大影响的特异性基因家族-C.melo pH 基因（CmpH），该基因在甜瓜品种中表现出高酸度和低酸度的自然遗传变异。通过在黄瓜和番茄中功能性沉默CmpH 的同源基因，成功获得了低酸度的果实，证明CmpH 基因调控甜瓜的果实酸度。Tzuri 等[6]发现，甜瓜果肉中类胡萝卜素的积累与CmOr基因的多态性相关联，CmOr基因与果肉颜色共同分离，且在种质资源中呈现两种单倍型：一种与橙色果肉相关，另一种则与白色或绿色果肉相关。形态学研究表明，甜瓜果肉硬度受多种因素的影响[7]，其中果肉细胞大小扮演着关键角色。细胞越小，甜瓜果肉质地越趋于坚硬[8]。杨丽萍等[9]的研究表明，在花后的35~40 d 期间，是软质与脆质甜瓜质地特征形成的关键阶段。此阶段内，两种甜瓜的果肉细胞面积、细胞间隙大小以及细胞壁酶活性均表现出显著差异。进一步表达分析证实细胞壁扩展酶基因（如CmEXP3、CmEXP5、CmEXP9）在软肉与脆肉甜瓜果肉中的表达模式存在明显区别。此外，Chen 等[10]通过QTL 定位技术，成功识别出一个控制甜瓜果肉硬度的主效位点（ff2.1），进一步利用F2群体将ff2.1位点精细定位到了一个包含3个功能基因的28.3 kb 区域内。这些发现不仅加深了对甜瓜果肉硬度遗传基础的理解，也强调了深入探究与甜瓜果肉硬度相关基因的重要性，对改良甜瓜质地至关重要。

随着高通量测序技术的进步，甜瓜双单倍体品系DHL92 的基因组已完成测序，组装的N50 scaffold大小为4.68 Mb，N90指数为78[11]。然而，由于标记覆盖不足和重组缺失，部分大且富含基因的scaffold未能被锚定，且已锚定的scaffold未定向。为解决这一问题，Argyris等[12]利用DHL92亲本品系的重测序数据，从未锚定的scaffold中开发了新的SNP标记，构建了由580 个单核苷酸多态性（SNP）组成的高分辨率遗传图谱。该图谱将354.8 Mb的序列（包含141 个scaffold，平均大小为2.5 Mb）锚定至12 条甜瓜染色体，且90%的组装结果得到了定向。此外，Lyu 等[13]对来自地方品种甜瓜（Cucumis melo ssp.agrestis）样本进行了染色体级别的基因组组装，并通过整合多个已测序的甜瓜基因组数据，构建了一个甜瓜泛基因组图谱。比较基因组分析揭示了340万个遗传变异，主要为缺失/存在变异（PAV），并与蔗糖代谢相关基因的功能调控密切相关。这些研究为甜瓜群体遗传多样性分析及果肉硬度的全基因组关联分析（GWAS）提供了依据。

Zhao等[14]基于1175个甜瓜样本的重测序数据，构建了全面的基因组变异图谱，并采用GWAS方法对16 个农艺性状进行了研究，发现了208个位点与果实质量、品质和形态显著相关，验证了GWAS 在发掘关键性状遗传变异中的有效性。基于这些研究，笔者收集了292份甜瓜种质资源，其中76%来自新疆地区，旨在通过群体重测序技术进一步揭示群体基因组变异和遗传多样性特征，采用GWAS方法鉴定与果肉硬度相关的基因，以期为甜瓜的遗传改良奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料及表型鉴定

本研究所用甜瓜种质资源群体，由新疆哈密市农业农机技术推广服务中心提供。甜瓜果肉硬度鉴定以所取瓜中心部位为观测对象，用品尝的方法鉴定果肉质地。根据鉴定结果，参照《西瓜种质资源描述规范和数据标准》[15]做以下分类：软（果肉质地松，含水量多）、脆（果肉质地较实，含水量适中）、柔（果肉质地实，含水量较少）、硬（果肉质地实，含水量较多）。

1.2 DNA提取及基因型分析

采用CTAB 法从新鲜幼叶中提取基因组DNA[16]。每份种质至少提取5 μg基因组DNA，将提取好的DNA 送华大基因公司进行文库构建和测序。每份种质的DNA 文库构建采用约500 bp 的插入片段大小，并按照制造商说明书（Illumina Inc.,9885 Towne Centre Drive, San Diego, CA 92121,USA）进行操作。所有种质均使用Illumina HiSeq 2500测序仪进行测序。

对下机数据Raw reads进行过滤，去除接头和低质量的Reads，以此保证信息分析质量。将过滤后的Clean reads 应用于后续分析。使用比对软件BWA[17]将Reads比对到参考基因组上。进一步使用SAMtools 过滤掉非唯一和未比对上的Reads[18]。Picard 包（http://broadinstitute.github.io/picard/，version:1.87）被用来过滤重复Reads。基因组分析工具包GATK被用来检测全基因组SNP变异[19]。在群体中等位基因频率低于1%、缺失率大于80%、杂合位点频率大于5%的SNP被剔除。

1.3 遗传多样性和群体结构分析

使用邻接法计算种质群体距离矩阵，构建系统发育树，并在MEGA 5.0[20]中展示。使用PLINK软件（版本1.90）计算连锁不平衡（LD），参数设置为–ldwindow-r2 0、–ld-window 99999、–ld-window-kb 1000。

1.4 全基因组关联分析和单倍型分析

仅使用群体中最小等位基因频率（MAF）≥0.05且缺失率＜0.1 的SNP 进行全基因组关联分析。使用EMMAX（版本beta）软件包基于混合线性模型进行关联分析。关联分析结果可视化采用qqman包进行[21]。通过Bonferroni 测试的显著性阈值（1/SNP 数目）定义了全基因组的显著性临界值。采用gene-HapR包进行单倍型及可视化分析[22]。

2 结果与分析

2.1 甜瓜种质群体基因分型

本研究聚焦于292份来自全球多个区域的甜瓜种质资源，包含157 个地方品种和135 个栽培品种，涵盖的分布区域包括中国、加拿大、美国、南非、苏联、日本、土耳其、匈牙利、印度和伊朗等，其中约76%的样本来源于中国新疆。利用新一代高通量测序技术，成功获得了3.57 T碱基的序列数据，平均每个样本的测序量为12.25 Gb，且平均测序深度为33 X，已覆盖甜瓜基因组的33 倍[12]。通过将测序数据读取比对至甜瓜参考基因组[12]，共识别了2 280 089 个SNP 标记（图1-A~B），平均每千碱基包含6.3 个SNP，显示出该群体中广泛的基因组变异。通过这一大规模基因组数据集的构建，将有助于甜瓜遗传多样性研究、关键性状基因的发掘以及群体遗传结构的深入解析。

2.2 甜瓜种质群体结构和连锁不平衡分析

基于全基因组SNP 数据，构建了甜瓜种质群体的系统发育树（图1-C），发现该群体可分为两个显著的分支：分支Ⅰ（Pop1）和分支Ⅱ（Pop2）。Pop1主要聚集了来自中国新疆、日本和苏联的地方品种，其中新疆地区的地方品种占绝大多数（90.84%，图2-A）。而Pop2 主要由栽培品种组成（图2-B），这些栽培品种分布广泛，包括中国（新疆、陕西、台湾、甘肃、内蒙古、辽宁）、日本、苏联、美国、加拿大、伊朗、土耳其、匈牙利、南非和印度等国家，其中新疆的栽培品种占67.5%。种质资源群体按果肉硬度性状可以分为脆、柔、软、硬4种，其中以脆和软为主（图2-C）。这一群体结构揭示了甜瓜种质在地理栽培环境以及果肉硬度上的高度分化，反映了地方品种和栽培品种之间的显著遗传差异，尤其是新疆甜瓜可能具有多样化的地理来源和果肉性状变异。

全基因组LD 分析进一步表明，整个甜瓜种质群体的LD 在衰减至一半（r²=0.33）时，标记对之间的距离为49.2 kb（图3）。然而，当分析地方品种和栽培品种时，LD 衰减至一半的距离分别为57.0 kb和45.9 kb，显示出栽培品种的LD 衰减速率较地方品种更快，提示栽培品种经历了更大的选择压力和遗传漂变。此外，核酸多态性分析表明，栽培品种的核酸多态性（2.537e-3）显著（p＜0.01）高于地方品种（1.989e-3），进一步证明了栽培品种在遗传多样性上的快速演化。

2.3 甜瓜种质群体果肉硬度变异及GWAS分析

基于表型性状（表1）和基因型数据，在甜瓜基因组的8 号染色体上发现了一个显著的关联信号（Chr08：2815957~2831112；p=2.36e-07，图4-A~B）。该区域包含11个显著的关联SNPs，能够解释9.04%的表型变异。

2.4 果肉硬度相关候选基因鉴定及单倍型分析

为了探究肉质相关的候选基因，参考群体LD衰减距离，笔者在最强关联SNP（chr08-2828062）上下游50 kb范围（Chr08：2768094~2867376）内共鉴定到了18个基因。基因组注释信息表明，在该关联区域鉴定到的基因主要为编码蛋白基因和酶，如硫酸腺苷转移酶（MELO3C007436.2），纤维鞘CABYR结合蛋白（MELO3C007438.2），肌醇转运蛋白（MELO3C007442.2），花粉绒毡层决定因子1 蛋白（MELO3C007447.2），核苷酸- 糖转运蛋白（MELO3C007449.2），E3 泛素蛋白连接酶（MELO3C007439.2） ，肌 醇 单 磷 酸 酶（MELO3C007440.2），环形E3 泛素转移酶（MELO3C007441.2），双功能3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶（MELO3C007451.2）等。转录组分析表明，有9个编码蛋白或酶基因在绿瓤和黄瓤的种质果肉中高表达（图5）。因此，推测这些蛋白和酶可能通过调控关键代谢生物合成路径来影响果肉硬度。

肌醇单磷酸酶（MELO3C007440.2）位于显著关联SNP（Chr08：2820234）上游24.98 kb 处，主要调控肌醇代谢，参与植物细胞壁多糖（尤其是果胶）合成和重塑[23]。显著关联SNP（Chr08：2830666）下游14 kb处鉴定到一个编码核苷酸-糖转运蛋白基因MELO3C007449.2。核苷酸糖是细胞壁多糖（包括果胶和半纤维素）合成的关键底物[24]，MELO3C007449.2有可能负责核苷酸糖从胞质转运到高尔基体，在细胞壁多糖合成中发挥重要作用。显著关联SNP（Chr08：2830666）下游30.49 kb 处鉴定到一个双功能3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶合成基因MELO3C007451.2（图4-C）。莽草酸途径是合成芳香族氨基酸的关键代谢通路，这些氨基酸是木质素和其他细胞壁相关次生代谢物的前体[25]，推测MELO3C007451.2 可能参与细胞壁强化和重塑过程。在MELO3C007451.2 编码区存在5 个SNPs，这些SNPs 处于强连锁不平衡水平，可以将群体划分为4个单倍型（图4-D~E）。98.05%的地方品种都享有hap001 单倍型。hap004 单倍型材料表现为软和脆，而硬质材料享有hap001，hap002 和hap003 单倍型（图4-F）。这些候选基因和单倍型为研究甜瓜种质资源群体分化和表型变异提供了新的视角。

3 讨 论

甜瓜是一种重要的经济果蔬作物，已经栽培了几千年。甜瓜作为一种形态多样的异交物种，普遍认为其起源于非洲[26-27]。Sebastian等[28]研究表明，甜瓜和黄瓜实际上都起源于亚洲。Zhao 等[14]研究表明，甜瓜经历了3次独立的驯化事件，其中两次发生在印度，一次发生在非洲。Luan等[29]评估了来自印度、非洲、克里特岛/希腊、日本、欧洲、美国、西班牙和中国68个栽培品种的遗传多样性，证实中国的甜瓜品种是甜瓜改良的丰富遗传多样性来源。笔者通过对292份来自全球多个区域的甜瓜种质资源进行高通量测序，成功构建了一个大规模的遗传变异图谱，为甜瓜基因组学研究和育种提供了数据支持。研究结果表明，甜瓜种质群体可分为两个显著的分支（Pop1和Pop2），其中Pop1主要由地方品种组成，Pop2则由栽培品种占主导。地理来源上分析发现，来自新疆的种质群体分散在了两个不同的亚群。来自美国、印度的资源和中国资源分布在了Pop2 中，支持了Luan等[29]的结论，即美国品种资源与中国厚皮甜瓜在形态学性状上非常相似。这一群体结构的差异反映了甜瓜在不同地理区域和栽培环境中的适应性演化，进一步加深了对甜瓜驯化和遗传演化的理解，尤其是新疆甜瓜的独特性，可能揭示了该地区丰富的地理多样性和栽培历史。

通过全基因组关联分析，笔者首次在甜瓜基因组中识别了与果肉硬度相关的重要SNP位点，并发现这些位点位于8 号染色体上的一个显著区域（Chr08：2815957~2831112）。该区域上下游50 kb区域内包含18 个基因，其中MELO3C007434、MELO3C007435、MELO3C007436、MELO3C007437、MELO3C007438、MELO3C007439、MELO3C007440、MELO3C007441 被证实为受选择基因，与野生种和栽培种分化相关[14]。笔者猜测这些基因可能在果肉硬度方面从野生种到栽培种驯化过程中扮演了重要角色。进一步基因注释结果表明，这些关联基因可能通过影响植物细胞壁的合成与重塑过程，进而调控果肉硬度性状。 肌醇单磷酸酶（MELO3C007440.2）和核苷酸- 糖转运蛋白（MELO3C007449.2）等候选基因，参与了果胶和细胞壁多糖的合成，可能是影响果肉硬度的重要调控因子。该研究结果和曾文芳等[30]的综述结论一致，即果实质地软化主要由细胞壁结构的改变和细胞壁组分的降解所引起。GWAS结合转录组分析数据进一步揭示了影响果肉硬度的细胞壁酶基因，特别是双功能3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶合成基因MELO3C007451.2。对口感不同的甜瓜材料细胞壁酶活性的研究结果表明，果实质地的变化受多个细胞壁扩展酶基因共同调控，并且花后35 d为细胞壁扩展酶基因表达的关键时期[9]，进一步支持了笔者的结论。因此，基于GWAS 结果，不仅有利于揭示果肉硬度的遗传基础，还为后续的分子机制研究提供了新的视角。这些发现为未来甜瓜育种中果肉硬度等性状的分子标记辅助选择提供了有力支持。

此外，笔者在群体中还发现了多个与果肉硬度相关的单倍型，这些单倍型的差异与果肉质地的表型变异密切相关。特别是在硬质和软质果肉的样本中，单倍型分化表现出明显的关联，突出了基因型与表型之间的联系。值得注意的是，硬质甜瓜普遍携带特定的单倍型（如hap001），而软质或脆性品种则主要表现为hap004等单倍型。这一结果为揭示甜瓜果肉硬度的遗传背景提供了有价值的线索，也为后续通过单倍型选择来进行品种改良提供了重要依据。

随着基因组学、表型分析和育种技术的持续发展，甜瓜在品质改良方面将迎来更加精准和高效的育种方法。通过深入解析甜瓜基因组的结构变异、PAVs以及功能变异，有望发现更多与果肉硬度等品质性状相关的关键基因。结合现代技术，如基因编辑和基因组选择，可以加速甜瓜品种的改良，特别是在提高消费者偏好的品质方面。

4 结 论

笔者研究分析了新疆甜瓜种质资源的遗传多样性，定位了与甜瓜果肉硬度相关的候选基因，发掘了与果肉硬度相关单倍型，为甜瓜果肉硬度及其他品质性状的遗传改良提供了新的分子标记，并为甜瓜分子标记辅助选择育种奠定了基础。

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Genetic diversity and GWAS analysis of flesh hardness trait in Xinjiang melon germplasm resources

ZHU Wanting1,2,LI Jiangfeng1#,ZHAN Qianru3,SHUA Zhenyang4,ZHU Yingchun5,GUO Yanxia1*,LUO Xiang2*

(1Hami Agricultural and Agricultural Machinery Technology Promotion Service Center, Hami 839000, Xinjiang, China;2College of Agriculture, Henan University, Kaifeng 475000, Henan, China;3Oil Crops Research Institute, Xinyang Academy of Agricultural Sciences,Xinyang 464000, Henan, China;4Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;5Institute of Western Agriculture,CAAS,Changji 831100,Xinjiang,China)

Abstract：【Objective】Melon, as an important global fruit and vegetable crop, is highly influenced by fruit flesh hardness and other quality traits, which directly affect its market competitiveness. Melon is widely cultivated worldwide and holds significant economic value,especially in Xinjiang,China,which serves as a major production hub. Xinjiang is the home to a diverse array of melon varieties, with key cultivation areas including Hami, Turpan, Korla and Changji. In recent years, the melon planting area has continued to expand, with Xinjiang accounting for one-third of the national production. However,the Xinjiang melon industry faces challenges such as severe homogenization, a reliance on a limited number of parental lines for breeding, and low breeding efficiency. Conducting genetic diversity analyses of melon germplasm and identifying key trait-associated genes and loci can provide critical information for developing genetic improvement strategies.This,in turn,can promote varietal diversity and en-hance the industry's market competitiveness. Flesh hardness is a key quality characteristic, however,and little research has been reported on the genetic basis of fruit flesh hardness in melon. This study aims to analyze the genetic diversity and population structure of melon germplasm and to locate genes associated to flesh hardness.【Methods】High-throughput sequencing technology was used to analyze the genomes of 292 melon accessions from around the world, constructing a large-scale genetic variation map.The Neighbor-Joining Method was applied to calculate the genetic distance matrix,and a phylogenetic tree was built. Genome-wide association analysis (GWAS) and haplotype analysis were performed in conjunction with the flesh hardness trait.【Results】The melon germplasm population was divided into two distinct branches: Branch Ⅰ(Pop1) and Branch Ⅱ(Pop2). Pop1 predominantly clustered local varieties from Xinjiang of China,Japan and the former Soviet Union,with Xinjiang varieties making up the majority(90.84%).Pop2 was mainly composed of cultivated varieties,widely distributed across various regions,including multiple provinces of China(Xinjiang,Shaanxi,Taiwan,Gansu,Inner Mongolia and Liaoning),Japan,the former Soviet Union,the United States,Canada,Iran,Turkey,Hungary,South Africa and India,with Xinjiang varieties constituting 67.5%.Genome-wide linkage disequilibrium(LD)analysis confirmed significant differences in genetic diversity and population structure between the two groups.LD analysis revealed that the LD decay distance for the entire melon germplasm population was 49.2 kb when r² decreased to half (r² = 0.33). However, when analyzed separately, the LD decay distances for landraces and cultivated varieties were 57 kb and 45.9 kb,respectively,indicating that cultivated varieties exhibited a faster LD decay rate than landraces.This suggests that cultivated varieties have undergone stronger selective pressures and genetic drift. Furthermore, nucleotide diversity analysis showed that the nucleotide diversity of cultivated varieties(2.537×10-³)was significantly(p＜0.01)higher than that of landraces(1.989×10-³),further supporting the idea of rapid evolution in genetic diversity among cultivated varieties. Through GWAS, we explored the variation of flesh traits,especially the important agronomic trait of flesh hardness.Based on phenotypic and genotypic data,we identified a significant association signal on chromosome 8 of the melon genome (Chr08:2815957_2831112; P= 2.36e-07).This region contained 11 significant associated SNPs, which explained 9.04%of the phenotypic variation.Functional annotation revealed that this region harbored candidate genes related to cell wall biosynthesis and remodeling, like inositol monophosphatase (MELO3C007440.2) and nucleotide-sugar transporter(MELO3C007449.2).These genes may influence flesh hardness by regulating the synthesis and remodeling of pectin and cell wall polysaccharides. Five SNPs were found in the coding region of MELO3C007451.2,which were in strong linkage disequilibrium,allowing the population to be divided into four haplotypes. The 98.05% of local varieties carried the hap001 haplotype.Hap004 haplotype materials exhibited soft and brittle characteristics, while hard materials carried hap001, hap002 and hap003 haplotypes.【Conclusion】The high geographical and cultivation environment differentiation of melon germplasm reflects significant genetic differences between local and cultivated varieties, especially the diversified geographical origins of Xinjiang melons.The study identified candidate genes associated with melon flesh hardness, including MELO3C007434, MELO3C007435,MELO3C007436, MELO3C007437, MELO3C007438, MELO3C007439, MELO3C007440 and MELO3C007441, which were confirmed as selection genes related to the differentiation between wild and cultivated species. We speculate that these genes may play a key role in the domestication process of flesh hardness from wild to cultivated species. In addition, candidate genes like inositol monophosphatase(MELO3C007440.2)and nucleotide-sugar transporter(MELO3C007449.2),involved in pectin and cell wall polysaccharide synthesis,may be important regulatory factors influencing flesh hardness.Fur-thermore, we discovered several haplotypes associated with flesh hardness in the population, and the differences in these haplotypes were closely related to phenotypic variation in flesh texture. Notably,haplotype differentiation showed a clear association between hard and soft flesh samples, highlighting the connection between genotype and phenotype.This study provides new molecular markers for the genetic improvement of melon flesh hardness and other quality traits,laying the foundation for marker-assisted selection in melon breeding.

Key words： Cucumis melo L.;Genome-wide association analysis(GWAS);Flesh hardness

中图分类号：S651

文献标志码：A

文章编号：1009-9980(2025)05-0979-14

DOI： 10.13925/j.cnki.gsxb.20240644

收稿日期：2024-12-11

接受日期：2025-02-21

基金项目：河南省农业援疆项目（202107）；新疆人才发展基金重点人才计划项目（XJARS-06-22）；新疆维吾尔自治区重点研发计划项目（2023B02017-2）

作者简介：朱婉婷，女，农艺师，研究方向为哈密瓜育种、栽培、病虫害防治。E-mail：1056835446@qq.com。#为共同第一作者。

*通信作者 Author for correspondence.E-mail：1726895607@qq.com；E-mail：tjaulx@126.com