云南7个澳洲坚果主栽品种果仁脂肪酸组分和含量分析

澳洲坚果（Macadamia spp.）又称夏威夷果，为山龙眼科（Proteaceae）澳洲坚果属（Macadamia F. Muell）多年生常绿乔木果树[1-2]。中国自1910 年引进，目前在云南、广西、广东、贵州等省份作为主要经济作物广泛种植。据国际坚果与干果理事会（简INC）不完全统计，世界澳洲坚果种植面积为54.27 万hm2，中国种植面积33.64 万hm2，约占全球种植面积的62%[3]。其中，云南澳洲坚果面积达27.57 万hm2，占世界的近50%和全国的80%。澳洲坚果仁富含脂肪酸、蛋白质、矿质元素等多种营养成分。相关研究发现，澳洲坚果仁主要的营养成分是脂肪酸，占干物质的78.52%[4]。脂肪酸是由碳、氢、氧三种元素组成的一类化合物，根据碳氢链饱和与不饱和可分为3类：饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）。研究表明长期摄入富含不饱和脂肪酸的油脂，可以显著降低血浆中低密度脂蛋白、总脂蛋白浓度和患心血管疾病的风险[5-6]。

不同品种澳洲坚果果仁的脂肪酸丰富[7]。宋海云等[8]对广西3 个澳洲坚果主栽品种（桂热1 号、OC、695）果仁的脂肪酸组分进行分析，发现果仁均含有18种脂肪酸并且含有人体必需脂肪酸，其中单不饱和脂肪酸的含量最高；杜丽清等[9]分析了广东湛江地区的8 个澳洲坚果品种（800、333、788、246、Own Wenture、Winks、Own Choice、H20），结果表明，果仁中粗脂肪含量在70%以上，含有肉豆寇酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生油酸和花生酸等8 种脂肪酸，所含脂肪酸种类以不饱和脂肪酸居多，其比例高达82.96%。杨为海等[10]研究了广东省湛江市28 份澳洲坚果种质（H2、OC、HAES246、HAES344、HAES695、HAES783、HAES788等），发现果仁主要含有8种脂肪酸，包括3种不饱和脂肪酸（油酸、棕榈油酸和二十碳烯酸）和5 种饱和脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸、花生酸、肉豆蔻酸、二十一烷酸）。康专苗等[7]研究了贵州5 种（Own Choice、 HAES788、 HAES695、 Hinde、HAES344）澳洲坚果，共检测出脂肪酸16种，其中有7种不饱和脂肪酸，总含量为85.89%，不饱和脂肪酸含量最高的是油酸，其次是棕榈油酸。由此可见，不同品种、不同地区澳洲坚果果仁脂肪酸种类和含量有所差异。

澳洲坚果作为一种营养健康食品在全世界广受到消费者青睐。早期云南种植的澳洲坚果品种繁多，后经适应性改良，选出A4、A16、HAES660、HAES788等一系列优质品种，其中A16、816、广11、HAES344、HAES660、桂热1 号、昌宁1 号7 个品种在云南的种植面积较大，且这7 个品种的果仁脂肪酸还未进行系统研究，因此笔者在本研究中利用LC-MS 结合单因素方差分析、PCA 和PLS-DA 对单位鲜质量澳洲坚果果仁的脂肪酸进行研究，为选择富含优质特定脂肪酸的品种提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料 A16、816、广11、HAES344、HAES660、桂热1号、昌宁1号澳洲坚果均来自于云南省保山市的云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所澳洲坚果种植基地（25°04′N，99°11′E，海拔799 m），树龄为11 a（年）。样品的收集采用对角线法[11]，在成熟期随机选取10株生长势相同且无病虫害的植株，在其冠层下、中、高、内、外采集60个澳洲坚果，随机分成3 组，每组20 个果实，随后带回实验室取样。将新鲜的青皮果脱壳取果仁立即用液氮速冻后贮藏于-80 ℃备用。

1.1.2 仪器与试剂仪器：AB SciexQTRAP®6500+质谱仪、AB SciexExionLC TMAD 液相色谱。

试剂：50 种脂肪酸标准品和5 种稳定同位素标记标准品购自上海甄准生物科技有限公司；异丙醇、乙腈、甲酸（LC-MS，Thermo-Fisher，美国），超纯水Mill-Q（Millipore，美国）。

1.2 方法

1.2.1 标准品准备准确称取50 种脂肪酸标准品，制备质量浓度为2000 μg·mL-1混标线性母液，甲醇稀释线性母液得到系列质量浓度分别为40 000、20 000、10 000、4000、2000、1000、400、200、100、40、20、10 ng·mL-1的工作液。配制一定浓度的Decanoicacid- d19、Myristicacid- d2、Octadecanoicacidd35、Eicosanoicacid-d39 和Lignocericacid-d4 溶液，混匀得到内标溶液（IS）。线性、内标和质控的母液及工作溶液均保存于-20 ℃冰箱，50 种标准品和5种内标的质谱检测参数见表1。

1.2.2 代谢物提取取100 μL样本，加入混合内标溶液300 μL（异丙醇∶乙腈=1∶1），混匀，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行LC-MS分析。

1.2.3 色谱、质谱方法色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）。

流动相：A相-0.05%甲酸水溶液；B相-50%异丙醇乙腈。柱温：50 ℃；进样量：2 μL；流速：0.3 mL·min-1。色谱梯度见表2。质谱条件：电喷雾电离源（ESI），负离子电离模式。离子源温度550 ℃，离子源压-4500 V，气帘气35 psi，雾化气和辅助气均为60 psi。采用多反应监测（MRM）进行扫描。

1.2.4 数据处理采用Excel 2019 对数据进行整理，采用SPSS26 软件进行单因素分析脂肪酸含量；采用SIMCA14.1 软件进行PCA 分析和PLSDA 分析，计算预测变量重要性投影（variable importance in projection，VIP），以VIP≥1 和VIP≥1.5为条件筛选差异脂肪酸成分；结果进行提取和可视化作图。所有数据均为3 个生物学重复的平均值和标准误差。

2 结果与分析

2.1 云南7 个澳洲坚果品种果仁SFA、MUFA 和PUFA分析

云南7 个澳洲坚果品种果仁的SFA、MUFA 和PUFA 检测结果见表3 和图1，SFA 占总脂肪酸含量的29.32%，7 个品种的SFA 含量范围为43 726.20~102 759.74 ng·g-1，变异系数为39.36%，广11 和HAES660 的含量最高，二者显著高于其余5 个品种。MUFA 占总脂肪酸含量最高，为61.71%，7 个品种的含量范围为53 590.74~343 559.73 ng·g-1，变异系数为74.71%，广11 的MUFA 含量显著高于HAES660，HAES660 显著高于A16、816、HAES344和昌宁1 号，A16、HAES344 和昌宁1 号显著高于桂热1号。PUFA占总脂肪酸含量最低，为8.97%，7个品种的含量范围为8 733.66~53 692.72 ng·g-1，变异系数为82.26%，广11显著高于HAES660，HAES660显著高于另外5个品种。

2.2 云南7个澳洲坚果品种果仁脂肪酸种类和含量分析

云南7个澳洲坚果品种的果仁脂肪酸组分检测结果见表4。7 个澳洲坚果品种的果仁中均检出了41种脂肪酸，其中SFA 13种，MUFA 18种，PUFA 10种。41种脂肪酸中以棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、异油酸和亚油酸为主，广11的棕榈酸、棕榈油酸、油酸、异油酸和亚油酸含量最高，分别为56 261.30、125 929.28、96 976.32、95 181.99和51 326.26 ng·g-1，HAES660 的硬脂酸含量最高，为42 448.98 ng·g-1，HAES660的棕榈酸、棕榈油酸、油酸、异油酸和亚油酸含量仅次于广11，分别为42 381.88、46 840.31、52 791.16、52 310.95 和19 096.30 ng·g-1。7 个品种的棕榈酸含量范围为20 218.83~56 261.30 ng·g-1，广11显著高于HAES660，HAES660显著高于另外5个品种，A16和816显著高于桂热1号。棕榈油酸含量范围为10 360.40~125 929.28 ng·g-1，广11显著高于HAES660，HAES660显著高于A16、816、桂热1号和昌宁1号，但与HAES344无显著差异。硬脂酸含量范围为13 438.66~42 448.98 ng·g-1，HAES660显著高于广11，广11显著高于A16、816、HAES344和桂热1号。油酸含量范围为18 969.29~96 976.32 ng·g-1，广11 显著高于HAES660，HAES660 显著高于A16、816、HAES344、桂热1 号和昌宁1 号，A16、HAES344和昌宁1号显著高于桂热1号。异油酸含量范围为18 741.46~95 181.99 ng·g-1，广11 显著高于HAES660，HAES660 显著高于A16、816、桂热1号和昌宁1号，A16、816显著高于桂热1号。亚油酸含量范围为7 435.72~51 326.26 ng·g-1，广11显著高于HAES660，HAES660 显著高于A16、816、HAES344和桂热1号。α-亚麻酸是人体必需的脂肪酸，广11 和HAES660 的含量较高，分别为1 619.06和1 777.21 ng·g-1，二者显著高于其余品种。与人体健康高度相关的多不饱和脂肪酸主要有二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），7 个品种中桂热1 号的EPA 含量最高，其次是HAES344，二者含量分别为6.26 和4.77 ng·g-1；DHA 含量最高的品种是816，其次是HAES660，二者含量分别为120.79和109.29 ng·g-1。

2.3 云南7 个澳洲坚果品种果仁脂肪酸PCA 和PLS-DA分析

为了更好地了解云南7个品种澳洲坚果果仁脂肪酸组成的差异，对脂肪酸数据进行了PCA 分析（图2）。第一主成分PC1、第二主成分PC2分别包含了原来信息量的55.5%和18.5%。在PC1方向上，广11和HAES660与其他5个品种明显分离，A16、桂热1 号、昌宁1 号、HAES344 和816 分布较集中，HAES660和广11位于正轴，而HAES344、816、桂热1 号、昌宁1 号和A16 位于负轴；在PC2 方向上，HAES660 与816、广11 明显分离，A16、HAES344、昌宁1号、桂热1号没有分离。

为了进一步分析不同脂肪酸对区分7 个澳洲坚果品种的贡献率，对7 个品种的41 种脂肪酸进行PLS-DA 分析，发现VIP＞1 作为筛选标准共筛选到16种特征脂肪酸（表5），其中有5 种饱和脂肪酸，分别为癸酸、硬脂酸、十三烷酸、十二烷酸、十五烷酸；4种单不饱和脂肪酸，分别为反式肉豆蔻烯酸、反式岩芹酸、十七碳烯酸（反-10）和十五碳烯酸（反-10）；7种多不饱和脂肪酸，分别为DHA、EPA、反亚油酸、二十二碳二烯酸（顺-13,16）、二十碳三烯酸（顺-11,14,17）、花生四烯酸和γ-亚麻酸。

以VIP 大于1.5 作为筛选标准共筛选到3 种特征脂肪酸（图3），分别为癸酸、DHA、花生四烯酸。816的癸酸含量最高，其次是广11，二者含量分别为54.63和47.38 ng·g-1，816和广11的癸酸含量显著高于HAES344，HAES344 显著高于HAES660，HAES660 显著高于A16、桂热1 号和昌宁1 号。DHA 含量最高的品种也是816，为120.79 ng·g-1，含量高于HAES344、HAES660 和桂热1 号，且显著高于昌宁1号，昌宁1号显著高于A16和广11。桂热1号的花生四烯酸含量最高，为148.76 ng·g-1，显著高于另外6 个品种，HAES344 显著高于816，A16、广11、HAES344、HAES660 和昌宁1 号之间无显著差异。

3 讨论

云南7 个澳洲坚果主栽品种中均检测出41 种脂肪酸，其中SFA 13 种，占总脂肪酸的29.32%；MUFA 18种，占总脂肪酸的61.71%；PUFA 10种，占总脂肪酸的8.97%；说明不饱和脂肪酸是澳洲坚果果仁脂肪酸的主要成分。这与康专苗等[12]、张国昌等[13]、Shuai 等[14]、O’hare 等[15]研究澳洲坚果果实品质MUFA含量最高，其次是SFA，PUFA含量最低的结果一致。贺鹏等[16]研究广西澳洲坚果脂肪酸结果含有SFA 11 种、MUFA 4 种和PUFA 3 种；Shuai等[17]研究云南澳洲坚果脂肪酸含有SFA 6 种、MUFA 4 种和PUFA 2 种；梁燕理等[18]研究广西澳洲坚果脂肪酸含有SFA 8 种、MUFA 4 种和PUFA 3 种。笔者在本研究中均检测出了以上文献报道的脂肪酸，种类多于文献报道的脂肪酸种类。脂肪酸在生物体内起着关键作用，它是构成生物膜的各种功能脂质分子的重要组成部分，是机体最重要的能量供应物质之一，在疾病发病机制等研究领域意义重大[19]。不饱和脂肪酸只会杀死癌细胞并降低癌细胞转移能力，对正常细胞没有不利影响[20]。研究表明，澳洲坚果的单不饱和脂肪酸含量在所有坚果中排名第一，不仅可以降低低密度脂蛋白胆固醇水平和心血管疾病的风险，还显著降低糖尿病患者的收缩压和舒张压，控制血压，抑制炎症。有文献报道，每周食用5 次坚果可减少50%的心血管疾病风险，而每周食用1~4 次则可减少25%的风险[5]。多不饱和脂肪酸含量是评价食用油营养水平的重要依据，具有抗血栓和抗动脉粥样硬化的特性，能够预防高血压、糖尿病、肾病等。

从脂肪酸含量上看，41 种脂肪酸中以棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、异油酸和亚油酸为主，这与文献报道的澳洲坚果中脂肪酸组成结果是相似的[21-23]。在云南7 个澳洲坚果品种中，广11 的总脂肪酸含量最高，棕榈酸、棕榈油酸、油酸、异油酸和亚油酸含量显著高于其他品种，HAES660的脂肪酸含量仅次于广11，棕榈酸、棕榈油酸、油酸和异油酸显著高于其他5 个品种，这与帅希祥[24]的研究结果相似。棕榈油酸属于Ω-7脂肪酸，可用于减少炎症，预防糖尿病和心血管疾病[25]。广11 的棕榈油酸是其余品种的2.69~12.15 倍，可作为广11 区别于其他6个品种的特征脂肪酸。油酸在代谢过程中具有降低血压、预防动脉粥样硬化、燃烧脂肪和对抗感染等多种功效[26]。在本研究中，广11的油酸是其余品种的1.84~5.11 倍。多不饱和脂肪酸中亚油酸和α-亚麻酸含量较高，广11 的亚油酸是其他6 个品种的2.69~6.90 倍，广11 和HAES660 的α-亚麻酸含量差异不大，是其余5 个品种的2.48~8.93 倍；亚油酸和α-亚麻酸是人体必需的2 种脂肪酸，适量摄入亚油酸和亚麻酸，具有降低血液胆固醇含量、健脑益智、改善视力等功效[23，27]。在PLS-DA 模型分析下，从VIP＞1.5 筛选出癸酸、DHA 和花生四烯酸，说明这3 种脂肪酸是7 个品种的主要差异代谢物，品种816的癸酸和DHA含量最高，桂热1号的花生四烯酸和EPA含量最高。DHA对儿童神经发育至关重要，且DHA 和EPA 有助于改善儿童精神障碍和双相情感障碍症状[19]。澳洲坚果种仁脂肪酸含量的显著差异对人们选择富含特定脂肪酸的品种具有重要利用价值。

主成分分析是一个采用少量综合指标来代替原来多个指标大部分信息的一种降维的分析方法，剔除不重要的部分，保留重要信息，在对樟树[28]、相思[29]等树种的研究中已经取得了较好的效果[12]。笔者在本研究中使用PCA提取了原变量74%的信息，并采用主成分得分图分析各个主成分和品种间的关系，PC1 与广11 和HAES660 呈正相关，与A16、HAES344、昌宁一号、桂热一号和816 呈负相关。A16、HAES344、昌宁一号、桂热一号和816 脂肪酸组分的相似性高。在PLS-DA 模型分析下，从VIP＞1.5 筛选出癸酸、DHA 和花生四烯酸，说明这3种脂肪酸是7个品种的主要差异代谢物。

4 结论

澳洲坚果是不饱和脂肪酸的良好来源，云南7个澳洲坚果品种的果仁均检测出41种脂肪酸，主要是棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、异油酸和亚油酸。广11 的脂肪酸含量最高，其次是HAES660，可作为高脂肪酸含量品种；棕榈酸、棕榈油酸、油酸、异油酸和亚油酸含量最高的品种是广11，硬脂酸和α-亚麻酸含量最高的是HAES660，癸酸和DHA 含量最高的是816，花生四烯酸和EPA 含量最高的是桂热1号。

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