猕猴桃主栽品种溃疡病抗性评价及生理指标分析

猕猴桃（kiwifruit），又名羊桃、毛桃、山洋桃、毛梨桃，含有丰富的维生素C，被称为“水果之王”，具有生津止渴、促进消化和美容养颜的功能[1]。根据联合国粮食及农业组织（FAO）最新数据（http://www.fao.org/faostat/en/），2022年中国猕猴桃收获面积近20 万hm2，占全球的70%，年产量238 万t，占全球的52%。溃疡病是严重威胁猕猴桃生产的毁灭性细菌性病害，能够在短时间内造成植株的大面积死亡，极大地限制了猕猴桃产业的发展[2]。虽然国内外学者已对病原菌的所属分类、生物学特性、致病力和快速检测方法开展了大量研究，但实际生产中对溃疡病仍缺乏有效的防控手段。筛选猕猴桃高抗栽培品种并深入解析其抗病机制，是当前猕猴桃溃疡病防控的首要任务[3]。

中国野生猕猴桃资源种类、储量及遗传多样性都十分丰富，经过长期的自然选择，猕猴桃种质资源中含有丰富的抗性基因，可为抗病基因的挖掘及抗性种质创新提供育种材料[4]。与田间自然发病情况调研相比，室内离体抗性鉴定可在一致条件下短时间内评价多份种质资源的抗病性，评价结果相对稳定可靠，主要在离体枝条和叶片上进行[5-6]。温家康等[7]利用离体枝条接菌法对28份新疆野核桃种质资源进行抗性评价，从中筛选出7 份高抗腐烂病种质。位杰等[8]采用离体枝条接菌法对90份梨种质资源进行梨火疫病的抗性评价，筛选到2份抗病和8份中抗资源，用于后续的育种基因挖掘。曹雅芝等[9]采用离体叶片和枝条接种梨火疫病菌的方法对83份野苹果资源进行抗性评价，鉴定出高抗资源1份，抗病资源4份。

植物主要通过两种方式抵御病原微生物的侵染：一是植物自身结构抵御微生物的入侵；二是植物细胞组织内的生化反应，产生对病原物有毒的物质或抑制病原物的生长[10]。Gao 等[11]发现番茄叶片过氧化物酶、脂氧合酶活性及总可溶性酚类物质和类木质素酚类聚合物的含量，与其抗青枯病菌的能力呈正相关。Archana 等[12]发现杧果生理指标中的可溶性固形物、总酚、总类胡萝卜素含量等与其炭疽病的抑制效果呈显著正相关。多项研究均证实植物生理指标与抗病性之间存在着紧密关联。

笔者拟以75个中华及美味猕猴桃品种（Actinidia chinensis var.chinensis and A.chinensis var.deliciosa）为试验材料，利用离体枝条及叶盘接菌的方法明确各个品种的溃疡病抗病性，进一步对抗性差异显著的品种进行生理指标分析，筛选高效准确的抗性评价指标，以期为猕猴桃的抗病育种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 溃疡病菌株 供试菌株M228 为猕猴桃溃疡病病原菌，丁香假单胞菌猕猴桃致病变种Pseudomonas syringae pv. actinidiae（Psa），分离自中国陕西眉县红阳猕猴桃，由西北农林科技大学植物保护学院果树病害综合防治研究团队保存[13]。

1.1.2 猕猴桃种质资源 试验所用的75 个中华及美味猕猴桃品种均保存于中国科学院武汉植物园的国家猕猴桃种质资源圃（武汉），树龄为3 a（年），整体树势生长良好。75个品种中含二倍体品种14个、四倍体品种35个和六倍体品种26个（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 离体枝条接种评价 参考张迪等[14]和裴艳刚等[15]离体致伤接种的方法，在2023年11月落叶后采集当年生猕猴桃健康枝条，选取直径约为0.8 cm 且长势一致的枝条，截成10 cm短枝条，石蜡密封两端以减少水分的流失。活化培养菌株，用接种环挑取M228的单菌落加入1 mL液体LB培养基，在28 ℃、180 r·min-1 振荡培养12 h，然后8000 r·min-1 离心5 min。稀释菌液至OD600=1.0，约109 CFU·mL-1。

使用打孔器在枝条上制造3 mm宽、深至木质部的伤口，接种菌液（OD600=1.0），以无菌水处理作为阴性对照。接种42 dp（iday post inoculation）后，用小刀刮除表面，使用游标卡尺测量病斑长度，做统计学分析。

根据枝条不同的病斑长度，对其抗性等级进行划分。基于张迪等[14]和裴艳刚等[15]的方法，对抗性等级的划分标准略作调整：抗病（resistant，R），病斑长度＜7.0 mm；耐病（tolerant，T），7.0 mm≤病斑长度＜9.0 mm；感病（susceptible，S），9.0 mm≤病斑长度＜11.0 mm；高感（high susceptible，HS），病斑长度≥11.0 mm。

1.2.2 离体叶片接种评价 参考Zhao 等[16]的方法进行离体叶盘真空渗透接种，采集大小均匀、长势一致的健康猕猴桃新叶，使用打孔器制备叶盘。将叶盘置于装有30 mL 菌悬液的100 mL 离心管中（OD600=0.000 1，约105 CFU·mL-1），用于真空渗透。无菌水清洗后，将叶背朝上贴于0.8%水琼脂的培养皿上，在16 ℃条件下置于L/D=16 h/8 h的人工气候箱中。接种培养5 dpi后，拍照，然后通过Image J软件对每个叶盘的病斑面积进行计算。

1.2.3 生理指标测定 参考李小方等[17]撰写的《植物生理学实验指导》测定生理指标。采集新鲜叶片，在同一天开展不同生理指标的测定。总酚含量采用分光光度法测定，加入试剂后在760 nm下比较不同品种溶液的吸光值；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法，糖在浓硫酸的作用下脱水生成糖醛或羟甲基糖醛，生成有色物质后在630 nm下测定各品种的吸光值；采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）在450 nm波长下测定木质素的含量[18]。每个指标测量3次重复，取平均值。

1.3 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016进行统计分析，并采用SPSS 21.0 软件进行比较分析，采用GraphPad Prism 8制作图表。

2 结果与分析

2.1 离体枝条接种溃疡病病菌后发病情况

离体枝条接种溃疡病病菌42 d 后，用小刀刮开韧皮部表面，可以观察到接种部位出现褐色病斑，从切口部位向两端延伸。不同品种的枝条病斑长度表现出差异，病斑长度分布在5～16 mm 之间（表1）。按照病斑长度将其划分为4个不同的抗性等级。如图1-A所示，从左至右病斑长度依次增加，对溃疡病的抗性也依次降低。其中，金魁、翠玉、金美的病斑长度均小于7 mm，为抗病品种；金桃、金艳的病斑长度在7～9 mm之间，为耐病品种；皖金、金圆、东红的病斑长度在＞9～11 mm之间，为感病品种；红阳的病斑长度为＞11 mm，为高感品种。根据离体枝条抗性等级的划分，可见抗病品种有16 个，耐病品种30个，感病及高感品种分别为19 个和10 个（图1-B）。进一步验证了中华及美味猕猴桃种质整体抗性较差，但其中也有抗性资源。

75个猕猴桃品种的抗性及倍性相关性如图2所示，从左至右分别为二倍体、四倍体、六倍体中的不同抗性品种数量分布。14 个二倍体品种中4 个抗病，5 个耐病，4 个感病，1 个高感，分别占比28%、36%、29%和7%；35个四倍体品种中4个抗病，15个耐病，8 个感病，8 个高感，其中耐病品种占比最大，为43%，其次为感病品种和高感品种，占比均为23%，抗病品种占比11%。六倍体品种共有26个，含8个抗病品种，10个耐病品种，7个感病品种，只有1个高感品种，其中耐病品种数量最多，其次是抗病品种，两者占比达到69%。

基于上述结果可以看出，虽然六倍体中抗病及耐病品种的比例相对略高，但二倍体、四倍体、六倍体品种中均有抗病、耐病、感病及高感等级的分布，品种倍性与抗病性之间并未呈现显著的正相关。因此，在筛选抗性资源引种驯化时，不能只依靠品种的倍性进行选择，要基于果实品质、抗性评价及生理指标分析进行综合选择。

2.2 离体叶盘接种溃疡病抗性评价结果

根据离体枝条抗性评价结果，选取9 个抗性等级不同的品种（抗病：金魁、翠玉、金美；耐病：金艳、金桃；感病：皖金、金圆、东红；高感：红阳）进行离体叶盘抗性评价试验，进一步验证其抗病性。接种菌液的叶盘培养后会逐渐生成黑褐色病斑，而接种水的叶盘（阴性对照）基本上不会出现黑褐色病斑，由此证实了结果的可靠性。光照培养5 d 后，不同品种的叶盘发病面积存在差异。以枝条抗性评价结果为参考，发现随着品种枝条溃疡病斑越长，对应叶盘病斑面积也越大，两者结果呈正相关，如图3所示。

运用软件计算病斑面积时，发现由于每个品种真空渗透的时间不同，叶盘可能会存在坏死的情况，需要挑取正常发病叶片计算发病面积，具体数值见表2。

9 个品种中，金魁、翠玉接种溃疡病病菌后，病斑占比最小，分别为3.51%和5.48%，均在6%以下。东红和红阳发病最为严重，病斑占比分别为45.79%和46.75%，均在40%以上。对不同品种的叶盘病斑占比与枝条病斑长度进行相关性分析，其相关系数达0.947 8，如图4所示，呈极显著相关。说明不同品种枝条病斑越长，叶盘病斑占比越大，对溃疡病的抗性越弱。

2.3 不同生理指标测定结果

对上述9个抗性差异品种采集叶片进行生理指标测定，发现不同品种的生理数据间存在差异。根据表3 可知，9 个品种叶片的总酚含量（w，后同）在3～6 mg·g-1之间，其中抗性品种翠玉的总酚含量最高，为5.7 mg·g-1，抗性品种金魁和金美总酚含量均大于4.7 mg·g-1；耐病品种金桃、金艳叶片中的总酚含量在4.4～4.6 mg·g-1之间；高感品种红阳的总酚含量最低，为3.07 mg·g-1。由此可见，随着品种抗性的降低，总酚含量呈现下降的趋势。同样，9个品种中抗性品种翠玉的可溶性糖含量最高，叶片中可溶性糖含量为29.88 mg·g-1，高感品种红阳的可溶性糖含量最低，为18.34 mg·g-1；可溶性糖含量也随着抗性的减弱呈降低趋势。针对木质素含量，抗病品种金美的最高，新鲜叶片中为9.59 mg·100 g-1，其次为翠玉和金魁，均属于抗病品种。随着溃疡病抗性的降低，木质素含量也在发生变化，其中，红阳的木质素含量最低，低于其他8个品种，只有8.87 mg·100 g-1。

综上可知，不同品种间的总酚、可溶性糖和木质素含量不同，但抗病品种中的含量均为最高，明显高于耐病品种及感病品种，高感品种中生理指标含量均为最低。

2.4 品种抗病表型和生理指标相关性分析

9个品种中金魁、翠玉、金美枝条和叶盘的病斑表型最小，而叶片中的总酚、可溶性糖和木质素含量均高于其他猕猴桃品种，为抗病品种；红阳枝条和叶盘的病斑表型最大，总酚、可溶性糖和木质素含量最低，属于高感品种。对不同品种间生理指标和枝条病斑长度进行相关性分析，如图5 所示，可见总酚含量、可溶性糖含量、木质素含量均与枝条病斑长度呈极显著负相关，相关系数分别为-0.927、-0.939、-0.871。

综合而言，溃疡病菌接种枝条后病斑长度越短，接种叶片后病斑占比越小，品种的抗病性越强，对应生理指标中的总酚、可溶性糖及木质素含量越高。相反，溃疡病病菌接种枝条后病斑长度越长，接种叶片后病斑占比越大，品种越易感病，对应生理指标中的总酚、可溶性糖及木质素含量越低。

3 讨 论

溃疡病是限制猕猴桃产业发展的重要病害之一，其防治方法主要有选择抗病品种、农业防治、化学防治和生物防治等[19]。相较而言，栽培抗性品种是提高猕猴桃抗溃疡病能力的最有效措施[20]。笔者对75 个中华及美味猕猴桃品种进行离体枝条室内抗性鉴定，结果显示不同品种对溃疡病的抗性不同，75个品种中有抗病品种16个，耐病品种30个，感病品种19个及高感品种10个，其中金魁为抗病品种，金桃、金艳为耐病品种，红阳为高感品种，该结果与宋雅林等[21]和崔丽红等[22]的鉴定结果一致。在离体叶盘抗性鉴定中，不同抗性等级的品种病斑占比不同，随着抗溃疡病能力的降低，其病斑占比也在逐渐增大。本研究显示，红阳占比最大，为高感品种，与枝条抗性结果显著相关，这也与Zhao等[23]在叶盘法中得到的结果相似。室内离体枝条接种与叶盘接种溃疡病病菌的方法具有极显著相关性，且与田间结果基本一致，证实基于两者开展猕猴桃溃疡病抗性鉴定是可靠的。

植物长期处在自然选择进化中，不同品种间抗性存在差异，其生理指标也存在差异[24]。Wang等[25]发现接种柑橘溃疡病病菌后，不同柑橘抗性品种过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性存在差异。酚类在植物中属于化感物质，对植物会产生直接、间接的促进或抑制作用。在辣椒中抗病品种的总酚含量高于感病品种[26]。糖是植物能量储存形式和物质转移媒介，在植物抗病性中发挥着重要作用。番茄接种病菌后，可溶性糖含量显著上升，说明糖与植物抗病性间存在紧密关联[27-28]。木质素是植物中复杂的生物化合物[29]，其与木质化和细胞壁有着显著的关联性，可以抵抗病原菌的侵入[30]。本研究显示，猕猴桃叶片生理指标中总酚、可溶性糖和木质素含量与猕猴桃抗溃疡病能力呈极显著正相关，当猕猴桃品种越抗病时，其叶片中总酚、可溶性糖和木质素含量越高。

基于本文结果，笔者发现虽然中华及美味猕猴桃品种对溃疡病的抗性较差，但仍存在抗病品种及耐病品种。通过离体枝条、离体叶盘抗性评价及总酚、可溶性糖和木质素含量等生理指标的分析，进一步验证了金魁、翠玉、金美属于抗病品种，皖金、金圆、东红为感病品种，红阳为高感品种，室内评价结果与田间结果高度一致。对于果实品质优良的抗病品种建议可以进一步推广栽培，对于品质稍差的抗性品种可将其作为亲本用于抗病杂交育种。此外，植物抗病性与生理指标之间存在显著的相关性，可以直接基于生理指标进行抗病种质的快速鉴定，或者基于这些指标可进一步开发抗性分子标记，加快猕猴桃抗性育种进程。

4 结 论

对75个猕猴桃品种进行了离体枝条抗性评价，从中得出16 个抗病品种，30 个耐病品种，19 个感病品种和10个高感品种。选择抗性差异的9个品种进行离体叶盘抗性评价及生理指标测定，发现室内离体叶盘评价和枝条接种溃疡病病菌的方法具有极显著相关性，离体叶盘病斑面积与品种抗病性存在显著负相关，总酚、可溶性糖及木质素含量与品种抗病性存在显著正相关，研究结果为猕猴桃育种及快速抗性鉴定提供理论基础。

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Evaluation on bacterial canker disease and analysis of physiological indexes in main kiwifruit cultivars

ZHU Jiahui1,2,LI Li2#,HE Di2,PAN Hui2,LI Wenyi2,ZHANG Qi2,WANG Rencai1*,ZHONG Caihong2*

(1College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China;2Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Chinese Academy of Sciences/Engineering Laboratory for Kiwifruit Industrial Technology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430074,Hubei,China)

Abstract: 【Objective】Kiwifruit bacterial canker disease is a devastating disease with a wide range,strong pathogenicity, rapid spread and difficult eradication, which is caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae.Although extensive research has conducted on the classification, biological characterization,pathogenicity analysis and rapid detection methods,there is still a lack of effective control technology in the production.Screening and analyzing the resistance mechanism of high-resistant varieties is crucial for the prevention and control of kiwifruit bacterial canker disease.【Methods】Seventy-five varieties of Actinidia chinensis var.chinensis and Actinidia chinensis var.deliciosa were used as materials.Healthy canes were collected after leaf fall.Canes with a diameter of about 0.8 cm and consistent growth were selected and cut into 10 cm stem.Both ends were sealed with paraffin to minimize water loss.A perforator was used to make a 3-mm-width xylem-deep wound on the cane.The wounded cane was inoculated with bacterial suspension (OD600=1.0), and sterile water was used as a negative control.Forty-two days after inoculation,the surface was removed with a knife and the length of the lesions was measured with a vernier caliper for preliminary evaluation of resistance.Then,nine varieties with significant resistance differences were further identified by the isolated leaf disc method.New healthy kiwifruit leaves of uniform size and growth were collected and leaf discs were prepared by the perforation method.After suspension vacuum infiltration and washing with sterile water, the leaves were placed with dorsal side up in petri dishes in an artificial climate chamber with L/D=16 h/8 h at 16 ℃,and the lesions were counted after 5 days of inoculation.Finally,resistance-related physiological and biochemical indices of the nine varieties were determined.The total phenol content was determined spectrophotometrically by adding reagents and comparing the absorbance values of different varieties’solutions at 760 nm;soluble sugar contents were measured by anthrone colorimetry at 630 nm for each variety;lignin content was determined by double-antibody one-step sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) at 450 nm.【Results】Brown lesions could be observed at the inoculation site forty-two days after inoculation,extending from the incision site to both ends.The length of the lesions of different varieties showed significant differences, ranging from 5 mm to 16 mm.75 kiwifruit germplasm resources could be categorized into four classes,i.e.,resistant,tolerant,susceptible and highly-susceptible according to the lesion length,which contained 16 resistant resources,30 tolerant resources,19 susceptible resources and 10 highly-susceptible resources.According to the results of the resistance evaluation of isolated canes, nine varieties with different resistance were selected for the isolated leaf disc resistance evaluation experiment to further verify their resistance.Leaf discs inoculated with the suspension would gradually produce black-brown spots after incubation, whereas the negative control of leaf discs inoculated with water basically showed no symptoms.After 5 days of light incubation, there was a difference in the area of leaf discs affected by different varieties.Among the nine varieties, Jin Kui and Cui Yu had the smallest percentage of spots after inoculation, being 3.51% and 5.48%, respectively,which were below 6%.Donghong and Hongyang had the most serious disease, with 45.79% and 46.75% of spots.The correlation analysis between the percentage of leaf disc spots and the lesion length on cane spots of different varieties showed a highly significant correlation of 0.948, confirming the reliability of both methods for resistance identification.Physiological indexes were measured on leaves of the above nine varieties with differences in resistance,and differences were found in the physiological data among different varieties.The values of total phenol content ranged from 3 to 6 mg·g-1,with the resistant variety Cuiyu having the highest total phenol content of 5.7 mg·g-1, and the highlysusceptible variety Hongyang having the lowest total phenol content value of 3.07 mg·g-1.With the variety resistance decreased,the total phenol content showed a decreasing trend.Similarly,the resistant variety Cuiyu had the highest soluble sugar content, with roughly 29.88 mg·g-1, but the highly-susceptible variety Hongyang had the lowest soluble sugar content of 18.34 mg·g-1; the soluble sugar content also showed a decreasing trend with the weakening of resistance.Regarding lignin content,the resistant variety Jinmei had the highest content of 9.59 mg of lignin per 100 g of fresh leaves,followed by Cuiyu and Jinkui, which were all resistant varieties.As the varieties’resistance decreased, the lignin content also reduced, and Hongyang had the lowest lignin content, with only 8.87 mg per 100 g of fresh leaves.In summary, it can be seen that the contents of total phenolics, soluble sugars and lignin differed among the different varieties, but the contents of resistant varieties were significantly higher than the tolerant and sensitive varieties.【Conclusion】The screened resistant germplasm lays a material foundation for the breeding and mechanism research on resistance to kiwifruit bacterial canker disease.There was a significant negative correlation between disease resistance and in vitro leaf disc resistance,and a significant positive correlation with physiological indicators,which can be used as a rapid identification method for resistant germplasm.

Key words: Kiwifruit;Bacterial canker;Resistance evaluation;Physiological index

中图分类号：S663.4；S436.634

文献标志码：A

文章编号：1009-9980(2024)11-2312-11

DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20240459

收稿日期：2024-09-09

接受日期：2024-10-16

基金项目：国家重点研发项目（2022YFD1400200）；湖北省第四批现代农业产业技术体系专项（2023HBSTX4-08)；湖北省重点研发计划项目（2022BBA0076）；国家现代农业产业技术体系（CARS-26）；植物基因组学国家重点实验室开放课题（SKLPG2016A-18）

作者简介：朱佳慧，女，在读硕士研究生，主要从事猕猴桃溃疡病抗性品种选育研究。E-mail：zhujiah2000@163.com。#为共同第一作者。李黎，女，副研究员，主要从事猕猴桃重大病害的致病机制及抗性种质创制研究。E-mail：lili@wbgcas.cn

*通信作者 Author for correspondence.E-mail：zhongch@wbgcas.cn；E-mail：wangrenc@163.com