猕猴桃FAD基因家族鉴定及其在采后成熟过程中的表达分析

脂肪酸是植物细胞的重要组成成分，它形成甘油三酯为生命活动提供能量[1]；作为细胞膜的关键成分维持细胞膜的稳态[2]；在生物胁迫中参与激素调节与信号转导[3]；在响应低温和干旱等逆境胁迫中发挥重要作用[4-5]；在果实成熟过程中通过LOX途径、α-氧化途径或β-氧化途径参与合成香气物质[6]。植物中以不饱和脂肪酸为主，饱和脂肪酸转化成不饱和脂肪酸的过程称为去饱和，是由一系列脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturases，FADs）来完成的[7]。FADs 根据溶解度可分为可溶性去饱和酶和膜结合去饱和酶。硬脂酰ACP去饱和酶（FAB2/SAD）是质体基质中唯一已知的可溶性FAD，它在Δ-9位置（从羧基端开始的第9号碳与10号碳之间）引入双键，催化硬脂酸转化为油酸，剩余的FAD 均是膜结合的[8]。根据功能不同，膜结合FADs 又进一步分为FAD2/FAD6（ω-6/Δ-12）、FAD3/FAD7/FAD8（ω-3/Δ-15）、FAD4（Δ-3）、FAD5/ADS（Δ-7）和DES/SLD五大亚族。其中，FAD2 和FAD6 是ω-6/Δ-12 去饱和酶，即FAD2在内质网、FAD6在质体中于油酸的Δ-12位置，也就是ω-6 位置（甲基端开始的第6 号碳与7 号碳之间）插入双键生成亚油酸[9]；FAD3 在内质网、FAD7 和FAD8 在质体中于亚油酸的Δ-15 位置（ω-3位置）插入双键生成亚麻酸[10]；FAD4 和FAD5/ADS都在质体中分别作用于磷脂酰甘油和单半乳糖二酰基甘油中的棕榈酸合成棕榈油酸[11]；DES 和SLD 都是在内质网中参与脂肪酸衍生物鞘脂代谢的酶，SLD催化t18∶0鞘脂长链碱基（LCB）C8位去饱和生成t18∶1 鞘脂[12]，DES 催化二氢鞘氨醇（d18：0）生成鞘氨醇-1-磷酸（d18：1），DES通常不会单独起作用，而是和SLD共同参与鞘脂代谢[13]。

1992 年有学者先后从拟南芥突变体中克隆得到FAD3 和FAD2[14-15]，1993 年和1994 年从拟南芥中先后克隆出FAD7 和FAD8[16]，1993 年从蓝藻中克隆出FAD6[17]，SLD 最先于1998 年从向日葵中分离得到[12]。目前研究比较多的是ω-6和ω-3型FAD基因，已经在香蕉[18]、茄子[19]、番茄[20]等中分离出其家族成员。当前对FAD 基因研究热点主要集中在抗逆功能，尤其是低温冷害胁迫，大量研究证实了脂肪酸去饱和酶能够调整膜脂不饱和脂肪酸的比例和成分，从而维持细胞膜流动性，达到增强对低温抵抗力的目的[21]。然而，关于FAD 基因在果实成熟中的功能鲜有报道。

果实中的挥发性芳香物质主要通过脂肪酸代谢途径、萜类代谢途径和氨基酸代谢途径合成。其中，直链脂肪族醇、醛、酮和酯类物质主要来源于脂肪酸的代谢，因此脂肪酸是形成果实香气物质的主要前体物质[22]。脂肪酸代谢途径中对香气物质合成贡献最大的是不饱和脂肪酸的代谢，这是通过LOX酶催化的第一步和随后的反应，通常被称为脂氧合酶途径。脂肪酸去饱和酶FAD 在脂肪酸碳氢链上引入双键，产生不饱和脂肪酸，在将油酸（18∶1）转化为亚油酸（18∶2）和亚麻酸（18∶3）过程中发挥着关键的作用[23]。

猕猴桃果实中因富含有机物质以及人体所必需的多种维生素而备受消费者青睐。猕猴桃在发育阶段（未成熟阶段）主要产生C6 醇和醛等“青香型”芳香物质，但在采收后熟过程中酯类等“果香型”芳香物质增多，因此常会散发出成熟阶段特有的果香味，也影响着消费者的偏好[24]。目前关于猕猴桃采后成熟过程中的香气研究较多，主要集中在贮藏处理方式、成熟度和品种等因素对其香气物质化学成分种类和含量比例的影响方面[25-26]，香气脂肪酸代谢合成途径的相关酶基因（如LOX、AAT、ADH等）也已被分离鉴定出来[27-29]。然而对其合成前体物质不饱和脂肪酸的研究鲜有报道，目前发现低温贮藏延缓了猕猴桃果实中亚油酸和亚麻酸的分解，抑制了脂肪酸LOX代谢途径中相关酶活性及其基因的表达，从而造成酯类香气物质的种类减少和相对含量降低，保持了较多醛酮类物质种类和较高的相对含量，维持了果实的特征风味[30]，其他相关的研究更多集中在猕猴桃籽和果肉中脂肪酸组分方面，发现其富含多种不饱和脂肪酸[31-32]，猕猴桃FAD 基因家族也未进行分离鉴定。红阳猕猴桃属于中华猕猴桃，因其果心具放射状红色条纹而得名，味甜，维生素C含量极高，香气浓郁[33]。因此，笔者以红阳猕猴桃为研究试材，采用生物信息学的方法对猕猴桃FAD基因家族成员进行分离和鉴定，然后再基于转录组数据对各成员在果实采后成熟过程中的表达模式进行分析，最后通过实时荧光定量PCR 验证FADs 基因的表达特性并筛选出差异表达的候选基因，为解析FAD 基因在猕猴桃果实采后成熟过程中不饱和脂肪酸代谢和香气物质形成的生物学功能提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

材料为红阳猕猴桃（Actinidia chinensis‘Hongyang’）果实。于2023 年8 月中旬（盛花后130 d 左右）从江西省奉新县果业局猕猴桃种质资源圃采摘试验果。选取树龄相同、长势良好的母树，采摘大小均匀、果形一致、无病虫害和机械损伤的果实，采摘当天立即运回实验室，经人工挑选剔除癍痂、伤果后置于阴凉通风处发汗到次日。经发汗散除田间热的果实用塑料袋密封贮藏于室温（20±1）℃中，于贮藏后0、4、10 d取样，每次随机挑选18个果实，6个果实为1次重复，设置3次生物学重复，经测量果肉硬度等成熟指标后去掉头部和尾部，剥除果皮、中柱和籽，取果肉部分混合均匀经液氮速冻后保存于-80 ℃备用。

1.2 猕猴桃FAD 基因家族成员鉴定及其蛋白特性分析

从猕猴桃基因组网站（https://kiwifruitgenome.org/）下载Hong Yang v3基因组数据，包括基因序列数据文件、蛋白序列数据文件、GFF3 注释文件等。从Pfam蛋白家族数据库（http://pfam.xfam.org/）下载FA_去饱和酶（PF00487）、FA_去饱和酶2（PF03405）和TMEM189（PF10520）结构域对应的隐马尔科夫模型（HMM）文件，使用TBtools（v2.102）中的Simple HMM Search，以e值≤1e-5为判据，与猕猴桃蛋白数据进行比对，初步筛选出AcFAD基因。然后使用SMART 数据库（https://smart.embl-heidelberg.de/）对初筛得到的候选蛋白序列进行结构域信息验证，最终确定了26 个猕猴桃FAD 基因家族成员。在猕猴桃基因组网站中获得这26 个AcFADs 编码区长度。利用蛋白分子质量计算-SMS2南京德泰生物镜像网站（https://www.detaibio.com/sms2/protein_mw.html）对26 个猕猴桃FAD 基因家族成员进行蛋白质理化性质分析，获得氨基酸数量、蛋白分子质量（MW）、等电点（pI）等。通过Cell-PLoc 2.0网站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）中的Plant-mPLoc对AcFAD蛋白进行亚细胞定位预测。

1.3 猕猴桃FAD 基因家族多序列比对与系统发育分析

拟南芥和黄瓜的FAD 蛋白质序列来自Cheng等[18]和Dong 等[34]的报道，利用MEGA（version 11.0）软件中的ClustalW对猕猴桃、拟南芥和黄瓜的FAD蛋白序列进行多序列比对。系统发育分析采用邻接法（neighbor-joining，NJ），在p-distance、部分删除50%和1000 次Bootstrap 重复参数下构建系统发育树，并使用Evolview v2（https://evolgenius.info//evolview-v2/）对进化树进行美化。

1.4 猕猴桃FAD 基因家族染色体定位和共线性分析

根据猕猴桃和拟南芥的全基因组序列文件和GFF3注释文件，使用TBtools中的Fasta Stats提取猕猴桃全基因组染色体长度并输出染色体骨架文件，利用One Step MCScanX 获得全基因组共线性文件并据此文件使用Text Block Extract and Filter提取猕猴桃FAD 家族基因共线性文件，使用File Transformat for MicroSynteny Viewer 提取配对基因对染色体信息，最后使用Advanced Circos 绘制猕猴桃FAD染色体定位图。使用One Step MCScanX-Super Fast对猕猴桃和拟南芥FAD 基因的复制事件进行共线性分析，并使用Dual Systeny Plot作可视化图。

1.5 猕猴桃FAD基因结构与蛋白保守基序分析

通过基因结构显示服务器GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）分析猕猴桃FAD基因的外显子-内含子基因结构。使用MEME 在线网站（https://memesuite.org/meme/tools/meme）分析AcFAD蛋白的保守基序，最大基序数设置为20，并利用TBtools 中的Gene Structure View绘制蛋白保守基序。

1.6 猕猴桃FAD基因家族启动子顺式作用元件分析

使用TBtools 从猕猴桃基因组数据库中提取每个AcFAD 基因起始密码子（ATG）上游1500 bp 启动子序列，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare-/html/）预测各个基因的启动子顺式作用元件，再利用TBtools对获得的顺式作用元件进行可视化绘图。

1.7 AcFADs在果实采后成熟过程中的基因表达分析

将常温贮藏0、4、10 d猕猴桃果实冷冻样品分装3 管设置3次生物学重复，在上海派森诺生物科技有限公司完成转录组测序。将获得的转录组数据提取上述26个AcFAD基因的FPKM值，将log（2FPKM+1）归一化处理后得到的数据使用TBtools 生成基因表达热图。

1.8 果实硬度的测量

使用质构仪（TMS-Touch，美国）测定果实的硬度，每个取样点随机选取18 个果实，重复测量3 次，单位：N[35]。

1.9 果实脂肪酸含量的测定

将猕猴桃果肉冷冻样品粉末2 g 与正己烷∶异丙醇（3∶2，体积比）15 mL 和6.7%Na2SO4 7.5 mL 混合，10 000g 离心10 min（4 ℃），上清液用氮气吹干。加入甲醇∶甲苯∶H2SO（488∶10∶2，体积比）制备脂肪酸甲酯（FAMEs）。冷却后，加入1 mL 庚烷和0.5 g无水Na2SO4进行FAME提取。为了检测脂肪酸含量，使用安捷伦6890 N气相色谱仪，配备火焰电离检测器和DB-Wax 色谱柱（0.25 mm，30 m，0.25 μm；J&W Scientific）。注入器和检测器温度为230 ℃。初始烤箱温度为50 ℃，以25 ℃·min-1速率增加到200 ℃，然后以3 ℃·min-1速率增加到230 ℃。载气为氮气，流速为1 mL·min-1。加入外源十七烷酸（C17∶0）作为内标定量计算脂肪酸含量。

1.10 RNA 提取、cDNA 合成及实时荧光定量PCR分析

使用多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（天根，北京）提取猕猴桃果肉总RNA，每个样品设置3次技术重复，然后通过凝胶电泳和超微量分光光度计（Bio-Rad，美国）测定提取的R N A 的质量和浓度。将提取好的RNA 使用三代逆转录预混液Mon-ScriptTM RTIII All-in-One Mix with dsDNase（莫纳生物，苏州）反转录成第一链cDNA，并用ddH2O稀释3倍，最后采用半定量PCR 检测cDNA 的质量。通过WoLF PSORT 网站（https://www.genscript.com/wolfpsort.html）设计实时荧光定量引物（表1）。实时荧光定量PCR（qPCR）分析参照之前的研究方法[36]。

1.11 数据统计与分析

所有数据结果以均数±标准误差（SD）表示。采用SPSS Statistics 25 软件中的单因素方差检验进行显著性差异分析并使用Duncan 新复极差字母标记法标注显著性，最后使用GraphPad Prism 8.0绘制图表。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃FAD 基因家族成员鉴定及其蛋白特性分析

笔者从Hong Yang v3 全基因组中共鉴定出26个FAD 基因家族成员（表2），根据其与拟南芥和黄瓜中FAD 基因亲缘关系的远近命名，包括2 个Ac-FAD2s，2 个AcFAD6s，3 个AcFAD3s，3 个AcFAD7s，1个AcFAB2，1个AcFAD4，3个AcFAD5s，2个AcADSs，7个AcSLDs和2个AcDESs。它们的编码序列（CDS）长度差异较大，范围为321 bp（AcFAD5.1）～4392 bp（AcFAD7.3），编码106～1463个氨基酸。蛋白质理论分子质量（MW）为11.51～161.8 ku，等电点为4.93（AcFAD5.1）～10.09（AcADS1.1），其中只有Ac-FAD7.3、AcFAD5.1 和AcSLD1.4 这3 个蛋白的pI 小于7，说明猕猴桃FAD蛋白大多数为碱性，少数为酸性。亚细胞定位预测结果表明，猕猴桃FAD蛋白定位比较分散，在植物细胞各结构中均有分布。其中AcFAD2蛋白都只定位在内质网中；AcFAD6蛋白只定位在叶绿体中；AcFAD3、AcFAD7 和AcADS 蛋白在叶绿体和内质网中都有定位；AcFAB2 定位在细胞膜和细胞核中；AcFAD4 定位在细胞膜、叶绿体、线粒体和细胞核中；AcFAD5.1 定位在细胞膜、叶绿体、高尔基体和细胞核中，另2 个AcFAD 只定位在内质网中；AcSLD1.1 定位在细胞膜和内质网中，其他AcSLD 只定位在内质网中；AcDES1.2 定位在细胞膜和内质网中，AcDES1.1只定位在内质网中。

2.2 猕猴桃FAD基因的系统进化树分析

为了阐明AcFAD蛋白的功能和进化关系，将26个猕猴桃、19个拟南芥和22个黄瓜的FAD蛋白序列构建了系统发育树。这些FAD 可分为6 个亚族，包括FAD3/FAD7/FAD8（ω-3/Δ-15）、FAD2/FAD6（ω-6/Δ-12）、FAB2（Δ-9）、FAD4（Δ-3）、DES/SLD 和FAD5/ADS（Δ-7），每个亚族分别有6、4、1、1、9 和5 个Ac-FAD成员（图1）。各亚族均有猕猴桃FAD家族成员的分布暗示着AcFAD 蛋白可能具有功能上的多样性。在大多数亚族中猕猴桃与拟南芥亲缘关系较近，与黄瓜的亲缘关系较远。

2.3 猕猴桃FAD基因的染色体定位和共线性分析

为了研究猕猴桃FAD 基因家族的遗传差异，分析了AcFADs 的染色体定位。结果（图2）显示猕猴桃Hong Yang v3基因组共有29条染色体，25个猕猴桃FAD基因分布在19条不同的染色体（LG）上，1个猕猴桃FAD 基因（AcSLD1.1）分布在Contig（CG）01622重叠群上。大多数FAD基因定位于染色体的前中端。0 和20 号染色体上都分布着3 个FAD 基因，1和15号染色体有2个FAD基因，剩下的15条染色体上（3、4、5、6、8、9、11、13、14、16、18、21、22、23和27 号）都只有1 个FAD 基因。由此可见，猕猴桃FAD基因和染色体存在一定的关联性。

为了进一步了解FAD基因家族的进化关系，进行了猕猴桃物种内以及猕猴桃与拟南芥物种间的共线性分析。种内共线性图谱显示有9对串联重复基因，分别是LG0 中的AcDES1.2、AcFAD7.2 和Ac-SLD2.1；LG1 的AcFAD6.2 和AcADS1.1；LG3 的Ac-FAD7.1；LG4 的AcFAD5.2；LG5 的AcFAD4 和Ac-SLD1.3。此外还鉴定出22 个猕猴桃FAD 基因产生了22 对片段重复基因，其中AcDES1.2（LG0）与AcDES1.1（LG20）存在共线性；AcFAD7.2（LG0）分别与AcFAD7.1（LG3）、AcFAD7.3（LG22）、AcFAD3.1（LG20）、AcFAD3.2（LG9）存在共线性；AcSLD2.1（LG0）与AcSLD2.3（LG23）、AcSLD1.1（CG01622）、AcSLD2.2（LG16）、AcSLD1.2（LG14）存在共线性；AcFAD6.2（LG1）与AcFAD6.1（LG15）、AcFAD7.1（LG3）、AcFAD3.2（LG9）存在共线性；AcADS1.1（LG1）与AcADS1.2（LG27）存在共线性；AcFAD7.1（LG3）与AcFAD3.1（LG20）、AcFAD3.2（LG9）、Ac-FAD7.3（LG22）、AcFAD3.3（LG15）存在共线性；Ac-FAD5.2（LG4）与 AcFAD5.3（LG11）、AcFAD5.1（LG21）存在共线性；AcSLD1.3（LG6）与AcSLD2.1（LG0）、AcSLD2.3（LG23）、AcSLD1.1（CG01622）存在共线性（图2）。由此可见，猕猴桃FAD 基因家族的串联重复事件伴随有片段重复事件，所以基因重复事件（串联重复和片段重复）对AcFADs 的多样性和进化具有促进作用。猕猴桃与拟南芥物种间共线性图谱显示，23 个猕猴桃FAD 基因与17 个拟南芥FAD 基因之间存在32 对共线性关系（图3），说明猕猴桃和拟南芥的FAD同源基因较多。

2.4 猕猴桃FAD基因结构与蛋白保守基序分析

为了深入了解AcFADs结构的异同，提取猕猴桃FAD 基因家族成员的CDS 序列及其基因组序列绘制了外显子-内含子基因结构图（图4），结果显示内含子数量在0～33 个之间，外显子数量在1～34 个之间（一般比对应内含子数目多1 个），其中FAD3/FAD7 家族中除了AcFAD7.3 内含子数量高达33 个外，其他基因成员的内含子数量都稳定在7～8 个；FAD2.1 没有内含子，FAD2.2 有1 个内含子，FAD6 成员各有7个和5个内含子，ADS成员均只有2个内含子，DES 成员均只有1 个内含子，FAD4、SLD、FAD5成员包含1～2 个内含子，FAB2 有4 个内含子。Ac-SLD1.2 和AcSLD2.2 没有5’UTR，AcFAB2 没有3’UTR，AcFAD7.3、AcADS1.2、AcFAD4 以及SLD 其余的5个成员没有5’UTR和3’UTR。由此可见，在同一分支中，大多数成员具有相似的长度和相同数量的结构分布。

通过在线网站MEME 预测了FAD 蛋白序列中的20 个保守基序（图5），结果发现大多数猕猴桃FAD 蛋白均含有motif 2、motif 4 和motif 14，且motif 2 和motif 4 基本都位于C 端，说明这些基序保守性较强，是典型的FAD结构域，可能行使相似的功能。motif 15是FAD5蛋白特有的基序，motif 18 和motif 19 是DES 蛋白特有的基序，FAD5 与DES蛋白共有motif 17，FAD4和ADS1.2蛋白没有保守基序，FAD3、FAD2和DES家族所有蛋白成员的基序种类、数量和排列方式各自完全一致。同一亚族内的蛋白表现出相似的基序组成，说明同一亚族成员高度保守，具有较近的亲缘关系。但亚族间也存在明显差异，说明一些基因在进化过程中发生了功能分化。

2.5 猕猴桃FAD基因启动子顺式作用元件分析

为探索猕猴桃FAD基因家族顺式作用元件的功能，对该家族上游1500 bp 的启动子序列进行了顺式作用元件预测（图6）。结果预测出47 种顺式作用元件，其中光响应元件数量最多，共计298 个（ACE 2个，AE-box 8 个，AT1-motif 4 个，ATC-motif 5 个，ATCT-motif 7个，Box 4 68个，Box Ⅱ1个，CAG-motif 1 个，chs-CMA1a 5 个，chs-CMA2a 4 个，GA-motif 4个，GATA-motif 20 个，G-Box 62 个，GT1-motif 28 个，I-box 9个，LAMP-element 4个，MRE 22个，Sp1 12个，TCCC-motif 10 个，TCT-motif 21 个，TGA-element 1个）；其次是植物激素响应元件（196 个），包括茉莉酸甲酯响应元件72 个（CGTCA-motif 36 个，TGACGmotif 36 个）、脱落酸响应元件59 个（ABRE）、生长素响应元件24 个（AAAC-motif 1 个，AuxRE 1 个，AuxRR-core 4个，TGA-box 2个，TGA-element 16个）、水杨酸响应元件21个（TCA-element）和赤霉素响应元件20 个（GARE-motif 8 个，P-box 7 个，TATC-box 5个）；再者是逆境胁迫响应元件（110 个），包括厌氧诱导所必需的元件69 个（ARE 60 个，GC-motif 9个）、低温响应元件23个（LTR）、参与防御和应激反应元件11 个（TC-rich repeats）和参与干旱诱导的MYB结合位点元件7个（MBS）；最后是植物生长发育相关元件（54 个），包括MYBHv1 结合位点元件13个（CCAAT-box）、与分生组织表达有关的元件12个（CAT-box）、参与玉米蛋白代谢调控的元件8 个（O2-site）、参与胚乳表达的元件7个（AACA_motif 1个，GCN4_motif 6 个）、参富含AT 的DNA 结合蛋白（ATBP-1）的结合位点元件6个（AT-rich element）、与昼夜节律控制有关的元件3个（circadian）、参与细胞周期调控的元件2 个（MSA-like）、参与叶绿体中胚层细胞分化的元件2个（HD-Zip 1）和参与黄酮类生物合成基因调控的MYB 结合位点元件1 个（MBSI）。此外，还有3个最大诱导剂介导的激活元件（2个）（AT-rich sequence）。除了AcADS1.1外，其他Ac-FADs启动子序列上均有激素响应元件，因此这些基因极有可能参与激素调控的生理过程；所有猕猴桃FAD 基因家族成员都含有逆境胁迫响应元件，所以猕猴桃FAD 基因在逆境胁迫应答过程中发挥着重要的作用；AcFAD6.2、AcFAD3.2、AcADS1.1 和AcADS1.2没有调控生长发育的顺式作用元件。

2.6 猕猴桃FAD基因家族表达模式分析

为了了解猕猴桃FAD 基因在采后成熟过程中的表达模式，对红阳猕猴桃采后0、4、10 d 果肉样品转录组数据进行了热图绘制以表征其表达丰度。结果（图7）显示，AcFAD3.1、AcFAD3.3、AcSLD1.4 和AcDES1.1这4个基因成员在猕猴桃整个采后成熟过程中均不表达；AcFAD6.1、AcFAD7.1、AcSLD1.2 和AcSLD2.1 在采后成熟早期（常温贮藏0 d）表现出最高的表达水平，随着后熟时间的增加其表达水平也随之下降，在成熟后期（常温贮10 d）达到最低的表达水平；AcFAD3.2、AcFAD5.3、AcADS1.1、AcADS1.2和AcFAD6.2 同样在采后成熟早期表现出最高的表达水平，但在采后成熟中期（常温贮4 d）表现出最低的表达水平，后期其表达水平又有所提高；Ac-FAD7.3、AcFAD5.1 在成熟早期和后期的表达水平一致，中期略有下降；AcFAD4 仅在成熟早期和中期表达且表达水平较低；AcSLD2.3 在成熟中期和后期表达水平基本一致，早期表达水平最低；Ac-SLD1.1 在成熟后期表达水平最高，中期表达水平最低；AcFAD2.1 只在成熟后期表达且表达水平极低；AcDES1.2、AcSLD1.3、AcFAD5.2、AcFAD7.2、Ac-SLD2.2、AcFAB2 和AcFAD2.2 的表达水平均随着成熟而不断提高，且值得注意的是AcFAD2.2的表达水平极高且各样点间表达水平增加1.4倍左右，后期相比于早期增加了2 倍。因此，猕猴桃FAD 基因家族各成员在猕猴桃采后成熟过程中有不同的表达模式，暗示着其在成熟过程中的各阶段发挥着不同的作用。

2.7 猕猴桃果实成熟过程中硬度和不饱和脂肪酸含量变化

在猕猴桃采后成熟过程中硬度呈下降趋势，并于采后10 d达到了可食用成熟度（图8-A）。不饱和脂肪酸是猕猴桃香气合成的重要前体物质，对采后猕猴桃果实中不饱和脂肪酸含量进行测定，发现油酸（OA，18∶1）含量随着猕猴桃采后成熟过程不断下降，亚油酸（LA，18∶2）则表现出与之相反的趋势，亚麻酸（LeA，18∶3）含量在成熟早期和中期无显著差别，而在后期含量显著降低（图8-B～D）。

2.8 猕猴桃FAD基因家族荧光定量分析

从猕猴桃转录组热图中挑选出在成熟后期差异表达上调的8 个基因（AcSLD1.1、AcSLD1.3、Ac-SLD2.2、AcSLD2.3、AcFAD5.2、AcFAD7.2、AcFAB2 和AcFAD2.2）进行了qPCR 验证。结果（图9）显示，在猕猴桃整个采后成熟过程中AcSLD1.3 表达量无显著变化；AcSLD2.2表达量先上调后下调但变化幅度不大；AcSLD1.1、AcSLD2.3和AcFAB2表达量在成熟早期和中期无显著变化，在后期显著上调，但表达量较低；与早期相比，AcFAD5.2在后期表达量显著上调，中期表达量相对于早期和后期无显著变化；AcFAD7.2和AcFAD2.2表达量都是随着成熟而不断显著上调，但AcFAD7.2表达量并不是很高，中期表达量相比于早期上调2.42 倍，后期上调量是早期的13.09 倍，而AcFAD2.2中期表达量比早期上调8.44倍，后期表达量比中期上调9.05 倍，后期上调量是早期的76.43倍，这与转录组数据的变化模式一致，因此推测Ac-FAD2.2 极有可能是参与编码猕猴桃采后成熟过程中ω-6 脂肪酸去饱和酶的关键候选基因，使得单不饱和脂肪酸转化为双不饱和脂肪酸，从而导致了油酸的减少和亚油酸的积累。

3 讨 论

脂肪酸去饱和酶对植物生长发育、抵抗生物与非生物胁迫和品质形成等方面具有正向的积极作用[1-4]。近年来，已经在多种植物中对FAD基因家族进行了鉴定，如亚麻中有43个[37]、茄子有38个[19]、核桃中有24个[38]、桃中有6个FAD基因家族成员[39]，而本研究中笔者首次在猕猴桃中鉴定出了26个FAD基因。由此可见，不同物种间FAD成员数量存在一定差异，这可能是其基因组大小不同和进化过程中某些基因的复制、分化或缺失造成的。对猕猴桃FAD家族蛋白序列进行理化性质分析发现，其分子质量与氨基酸数量成正比，而在茄子[19]、番茄[20]和亚麻[37]等中也有同样的规律。猕猴桃FAD的亚细胞定位结果发现FAD2s 和多数SLDs/DESs 都定位在内质网中，FAD6s定位在叶绿体中，FAD3s/FAD7s定位在叶绿体和内质网中，说明不同成员在这些不同的特定部位中发挥作用，与前人的研究结果一致[9-10,12]。猕猴桃与19个拟南芥FAD同样都可以分为6大亚族，在FAB2和FAD4亚族中这两个物种都只有一个FAD成员，而在其他亚族中成员数量分布存在较大的差异（尤其是SLD和FAD3/FAD7/FAD8亚族），该现象与番茄FAD家族相似[20]，暗示着这些亚族基因在进化过程中可能发生了特异性扩增。本研究在猕猴桃FAD家族中鉴定出9对串联重复基因和22对片段重复基因，同样地在甘蓝型油菜FAD 家族中存在3 对串联重复和25 对片段重复基因[8]、在小麦中形成26对串联重复和126 对片段重复基因[40]，因此推测FAD基因家族的扩增主要是基因片段引起的。具有相似的外显子-内含子基因结构的AcFAD成员通常聚为同一分支，且其编码的蛋白具有相似的基序组成，但也有部分成员（AcFAD4 和AcADS1.2）丢失了保守基序，在茄子FAD相应亚族中也发现此现象[19]，说明FAD 家族在物种间具有相对保守的进化趋势。对猕猴桃FAD启动子序列进行分析，发现大量的光响应元件、植物激素响应元件（茉莉酸甲酯，脱落酸，生长素，水杨酸，赤霉素）、逆境胁迫响应元件（厌氧，低温，干旱）和生长发育相关元件，尤其是逆境胁迫响应元件遍布在每个成员中，说明猕猴桃FAD 的表达受到光的调控，并广泛参与了植物生长发育、成熟及抗逆过程，在其他呼吸跃变型果实中（如番茄和香蕉等）也发现了相同的顺式作用元件[18，20]。

果实风味作为水果重要的品质性状，是在成熟过程中形成的品质之一，也是影响其销量以及消费者偏好的重要因素，果实的风味取决于糖酸以及挥发性芳香化合物的种类和含量。猕猴桃作为典型的呼吸跃变型果实，在成熟过程中，存在明显的呼吸跃变并促发内源乙烯大量合成，从而加速各种挥发性化合物的合成，逐渐产生独特的果香。在LOX途径中，亚油酸和亚麻酸首先被氧化为脂肪酸氢过氧化物，随后被氢过氧化物裂解酶裂解形成己醛和己烯醛。然后，C6醛通过醇脱氢酶还原为相应的C6醇，随后通过醇酰基转移酶转化为酯[30]。哈密瓜亚麻酸含量在贮藏过程中均有所增加，贮藏前期油酸含量急剧增多而中后期则呈下降趋势，亚油酸含量与之相反，呈上升趋势[41]，这与本研究中发现猕猴桃在采后成熟过程中油酸含量随成熟进程而显著下降，亚油酸表现出与之负相关的趋势，亚麻酸含量在早中期无显著变化，而在后期有所下降的现象一致。同时，也有研究表明油酸在油棕果实采后成熟阶段含量均减少，而亚油酸只在成熟早期阶段减少，却在后期阶段显著增加[42]。番茄果实成熟阶段亚油酸含量最高，油酸含量下降，亚油酸含量逐渐升高，亚麻酸含量无显著变化[43]。以上研究表明大多数果实成熟过程往往伴有亚油酸含量的增加和油酸含量的下降。但也有研究发现了与本研究不一致的现象，如杧果采后成熟过程中亚油酸含量逐渐下降，亚麻酸含量逐渐升高[44]，在香蕉果实的成熟进程中亚麻酸增加，呼吸跃变前期亚麻酸含量增加缓慢，至呼吸跃变上升期迅速增加，而亚油酸含量则有所下降[45]。这可能是热带水果和亚热带水果差异及其芳香物质种类不同所致。

基于FAD 家族在猕猴桃成熟各阶段的表达模式，发现了AcFAD7.2 和AcFAD2.2 这两个表达量均随着成熟而不断显著上调的家族成员。前人研究显示，在油茶和拟南芥中分别同源和异源过表达ω-3脂肪酸去饱和酶CoFAD7 后，亚麻酸的含量显著增加并且提高了亚麻酸/亚油酸的比值[46]。此外，在烟草中分别过量表达桃PpFAD3-1 和PpFAD3-2 后发现亚油酸含量大幅下降，亚麻酸含量显著上升[47]。但在本研究中并未发现亚麻酸含量增多，反而出现下降，说明猕猴桃成熟过程中亚麻酸的合成速率可能低于其作为前体物质参与芳香物质合成的速率，造成亚麻酸积累量降低，因此编码ω-3 脂肪酸去饱和酶基因AcFAD7.2 在猕猴桃采后成熟不饱和脂肪酸合成和积累中发挥的作用并不是很显著。对大肠杆菌中异源表达桃的PpFAD2-1 和PpFAD2-2 及其酶活性分析，发现这两个ω-6 脂肪酸去饱和酶基因都能促进油酸向亚油酸的去饱和[48]；对橄榄进行Oe-FAD2-2 和OeFAD2-5 超量表达，发现其具有将油酸转化为亚油酸并提高亚油酸含量的能力[49]；在番茄中进行异源酵母表达SlFAD2-1 和SlFAD2-2 能将油酸转化生成亚油酸并显著增加了亚油酸含量[50]。在本研究中也同样发现了油酸含量减少和亚油酸含量增多的现象，作为与番茄SlFAD2-1和SlFAD2-2高度同源的ω-6 脂肪酸去饱和酶基因，AcFAD2.2 的表达水平也随着成熟而不断攀高，其表达模式与其发挥作用的两种不饱和脂肪酸（油酸和亚油酸）含量变化存在明显的正相关，说明AcFAD2.2是参与猕猴桃采后成熟过程中脂肪酸代谢的关键基因，在不饱和脂肪酸合成与积累过程中发挥着极为重要的作用。

4 结 论

笔者在猕猴桃中鉴定出了26 个FAD 基因家族成员，根据其发挥作用的部位被定位到细胞的不同部位，因此绝大多数成员定位于内质网或叶绿体中，这些成员随机分布在19条不同染色体上，片段重复事件是猕猴桃FAD扩增和进化的主要动力，在猕猴桃FAD启动子序列上发现大量的光响应元件、植物激素响应元件（茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素、水杨酸、赤霉素）、逆境胁迫响应元件（厌氧、低温、干旱）和生长发育相关元件。猕猴桃采后成熟过程中油酸含量下降、亚油酸含量增多，并且AcFAD2.2 表达水平随着成熟而不断显著上调，由此可以推断出Ac-FAD2.2是油酸去饱和生成亚油酸的关键酶基因，并且可能会通过光、激素等响应方式在猕猴桃采后成熟过程中表达来调控不饱和脂肪酸的合成与积累。因此，今后可借助分子生物学技术对此关键候选基因进行克隆、功能验证和上游调控试验，深入解析猕猴桃FAD 基因在采后成熟过程中不饱和脂肪酸积累和香气物质合成中的功能机制和调控网络。

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Identification of the FAD gene family in kiwifruit and its expression analysis during postharvest ripening

YANG Caining,ZHANG Yupei,YANG Congcong,CHEN Jinyin*,GAN Zengyu*
(Jiangxi Provincial Key Laboratory for Postharvest Storage and Preservation of Fruits & Vegetables/Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,Jiangxi,China)

Abstract: 【Objective】Unsaturated fatty acids play many physiological roles in plants, including the formation of triglycerides to provide energy for plant life activities;maintaining cell membrane homeostasis as a key component of cell membranes; participating in hormone regulation and signaling during biotic stress;playing an important role in responding to adversity such as low temperature and drought;and participating in synthesizing aroma substances as precursors during fruit ripening via the LOX pathway,α-oxidation pathway,or β-oxidation pathway.During fruit ripening,the unsaturated fatty acids are used as precursors to synthesize aroma substances through the LOX pathway,α-oxidation pathway,or βoxidation pathway.At the same time,the unsaturated fatty acids also help the human body in numerous ways, including lowering lipids and blood pressure, enhancing fat metabolism, decreasing thrombosis,enhancing autoimmunity,and having anti-tumor properties.However,the human body is unable to synthesize unsaturated fatty acids,such as linoleic acid and linolenic acid,which can only be ingested from the diet.The animal body contains a high concentration of saturated fatty acids,whereas the plant body contains primarily unsaturated fatty acids.The fatty acid desaturases (FADs) are a group of enzymes that carry out the desaturation process,transforming saturated fatty acids into unsaturated fatty acids.To date,the FAD gene family has been identified in several species;however,it has not been reported in kiwifruit.In addition,most of the current studies on FAD genes have focused on the antistress function of unsaturated fatty acids, with little focus on how these fatty acids affect aroma volatiles.Therefore, the aim of this study was to isolate and characterize the kiwifruit FAD gene family and to clarify its expression pattern in kiwifruit during postharvest ripening and its relationship with the changes in unsaturated fatty acids,so as to lay a theoretical foundation for analyzing the formation of characteristic aroma in kiwifruit during postharvest ripening.【Methods】Based on the Hong Yang v3 genomic data of Actinidia chinensis, we downloaded the Hidden Markov Model (HMM) file corresponding to the structural domains of the fatty acid desaturase from the Pfam protein family database and used Simple HMM Search in TBtools (v2.102) to preliminarily search the AcFAD genes with the kiwifruit protein data, and then used the SMART database to verify the structural domain information of the candidate protein sequences to finalize the kiwifruit FAD gene family members.Then we used the SMART database to validate the structural domain information of the initial screened candidate protein sequences to identify the kiwifruit FAD gene family members; we used the protein molecular weight calculation (SMS2) Nanjing DETA Bio-mirror website to analyze the physicochemical properties of the kiwifruit FAD gene family members; and we used the Cell-PLoc 2.0 website to predict the subcellular localization of the proteins;A phylogenetic evolutionary tree of FAD protein sequences of kiwifruit,Arabidopsis thaliana and cucumber was constructed using MEGA (version 11.0) software; the chromosomal localization was mapped using Advanced Circos in TBtools,and the replication events of kiwifruit and Arabidopsis thaliana FAD genes were analyzed by One Step MCScanX-Super Fast.The covariance analysis was performed; the exon-intron gene structures were analyzed by GSDS, a gene structure display server; the conserved motifs of AcFAD proteins were analyzed using the MEME online website; the promoter cisacting elements of each gene were predicted using PlantCARE;and the gene expression heatmaps were generated using TBtools by normalizing the FPKM values of the transcriptomic data obtained.The expression pattern of the FAD genes was explored;the hardness and fatty acid content were determined using mass spectrometry and gas chromatography; and the expression characteristics of the FAD genes were verified with the help of the real-time fluorescence quantitative PCR during post-harvest ripening.【Results】In this study, a total of 26 FAD gene family members were identified from the whole Hong Yang v3 genome of Actinidia chinensis.These 26 kiwifruit FAD genes were named based on how closely they resembled the counterparts identified in Arabidopsis thaliana and cucumber.These genes were divided into six subfamilies: FAD3/FAD7/FAD8 (ω-3/Δ-15), FAD2/FAD6 (ω-6/Δ-12), FAB2 (Δ-9),FAD4(Δ-3),DES/SLD,and FAD5/ADS(Δ-7),each with a different number of subfamily members.All subfamilies had kiwifruit FAD family members,suggesting that the AcFAD proteins might be functionally diversified.A handful of them were acidic,but the majority were basic.The subcellular localization prediction revealed that kiwifruit FAD proteins were relatively dispersed in their localization and are distributed in all plant cell structures, with the highest number in the endoplasmic reticulum, followed by chloroplasts and cell membranes;the chromosome localization showed that the kiwifruit Hong Yang v3 genome had a total of 29 chromosomes,and 25 kiwifruit FAD genes were distributed on 19 different chromosomes (LG).The majority of the FAD genes were localized in the anterior-middle end of the chromosomes.The segmental duplication events contributed to the diversity and evolution of the Ac-FADs,as evidenced by the 22 pairs of segmental duplicates and 9 pairs of tandem duplicates found in kiwifruit according to the intraspecific covariance mapping; the covariance mapping between kiwifruit and Arabidopsis thaliana interspecies covariance mapping showed the 32 pairs of covariance between the 23 kiwifruit FAD genes and the 17 Arabidopsis thaliana FAD genes, suggesting that kiwifruit and Arabidopsis thaliana would have more FAD homologous genes.In the same branch, most of the members had similar length and the same number of gene structures.The conserved motif analysis revealed that most kiwifruit FAD proteins contained motif 2,motif 4,and motif 14.Moreover,motif 2 and motif 4 were basically located at the C-terminal end,indicating that these motifs were strongly conserved and were typical FAD structural domains, which might perform similar functions.A large number of the light-responsive,phytohormone-responsive(methyl jasmonate,abscisic acid,growth hormone,salicylic acid, gibberellin), stress-responsive (anaerobic, low temperature, drought), and development-related components were found in the FAD promoter region of kiwifruit, and the heatmap expression pattern analysis and qPCR validation experiments showed that the expression of the AcFAD7.2 and the Ac-FAD2.2 were significantly up-regulated with maturation.During the postharvest ripening process, the content of monounsaturated fatty acids(oleic acid)decreased significantly,while the content of diunsaturated fatty acids (linoleic acid) increased significantly, and the content of polyunsaturated fatty acids(linolenic acid)did not significantly vary with the early and middle stages of ripening,while the content of polyunsaturated fatty acids(linolenic acid)decreased significantly during the late stage;the hardness of kiwifruit rapidly decreased after harvest,and a distinct post-ripening process took place that resulted in the formation of the distinctive aromatic ester substances.The characteristic fragrance esters were produced as a result of this process,and the primary precursor for the synthesis of the ester aroma compounds was linoleic acid.【Conclusion】A total of 26 kiwifruit FAD gene members were identified.A significant decrease in the oleic acid content was accompanied by a significant increase in the linoleic acid content during postharvest ripening of kiwifruit.The variations in the oleic and linoleic acid were highly and positively linked with the expression of the ω-6 fatty acid desaturase gene AcFAD2.2.This expression was consistently and considerably up-regulated throughout ripening.Although the expression of the ω-3 fatty acid desaturase gene AcFAD7.2 was up-regulated, the linolenic acid content remained essentially unchanged or even decreased.Therefore,the AcFAD2.2 would be a key enzyme gene involved in the synthesis and accumulation of unsaturated fatty acids in kiwifruit during postharvest ripening,and the increase in the linoleic acid content was accompanied by the characteristic aroma emitted by kiwifruit during postharvest ripening.This paper would provide a reference basis for further investigation of the biological functions of the FAD genes involved in the transformation of unsaturated fatty acids and aroma synthesis during the course of the postharvest ripening in kiwifruit.

Key words: Kiwifruit;FAD gene family;Unsaturated fatty acids;Aroma synthesis;Gene expression

中图分类号：S663.4

文献标志码：A

文章编号：1009-9980(2024)11-2195-19

DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20240466

收稿日期：2024-09-09

接受日期：2024-10-26

基金项目：国家自然科学基金（32302627）；江西省自然科学基金（20232BAB205040）

作者简介：杨彩宁，女，在读硕士研究生，研究方向：果实采后生理及分子生物学。E-mail：ycn18859184090@163.com

*通信作者 Author for correspondence.E-mail：jinyinchen@126.com；E-mail：ganzy@jxau.edu.cn