葡萄（Vitis vinifera）是世界性重要果树之一，品种众多，且果实能够广泛用于鲜食、酿酒、制干、榨汁等，在果树产业中占有重要地位[1]。其中色泽是影响葡萄果实品质的重要性状之一，决定了其外观品质、营养价值、加工性能和经济效益[2]。因此，有色葡萄品种的着色状况是影响果实品质和市场竞争力的重要因素，生产色泽均匀、饱满的优质商品果是葡萄育种和栽培的重要目标[3]。然而，全球气候变暖，极端气候频发，夏季高温多湿、昼夜温差小，以及设施栽培过程中的弱光等因素，造成果实着色不良的现象常有发生[4-5]，其中在红地球、妮娜皇后等鲜红色品种中尤为突出[6]。
妮娜皇后作为近些年颇受葡萄生产者关注的鲜食品种，其果粒大而饱满、果皮色泽鲜红、口感与风味俱佳，但在部分南方产区由于昼夜温差小、光照不足等原因，存在果实着色不佳的问题。因此，解决南方产区葡萄果实着色问题，是满足妮娜皇后等品种优质化生产的迫切需求[7]。
传统改善葡萄果实着色的栽培技术包括树干环剥[8]、除叶[9]和疏果[10]等，这些栽培方式往往耗费大量的劳动力，且对生产者有较高的技术要求。而喷施植物生长调节剂、叶面肥等作为低成本、快速高效的栽培措施，已在改善果实色泽、提高果实品质等方面广泛应用[11]，其中脱落酸（ABA）[12]、乙烯[13]、茉莉酸[14]等成熟相关的植物激素，已被证明能够通过调控VvCHS、VvUFGT、VvDFR、VvMYB90 等花色苷合成相关的结构基因和转录因子的表达，进而促进果皮中花色苷的积累。然而，目前缺乏不同激素及植物生长调节剂在改善妮娜皇后果实着色与品质作用优劣的相关结论。
为此，笔者在本研究中以南方产区设施生产的妮娜皇后为研究对象，在果穗转色前实施喷施不同植物生长调节剂、氨基酸肥以及铺设反光膜等栽培措施，并通过比较不同处理后果实着色与品质形成的差异，以期筛选到合适的栽培措施，进而改善果皮着色、提升果实品质。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验在温州乐清市联宇葡萄研究所试验基地（121.11°E，28.28°N）进行，试验品种为5 年生妮娜皇后。葡萄植株为南北行向，株行距1 m×3 m，采用连栋避雨大棚和飞鸟形架，植株生长健壮且长势一致，按常规栽培措施统一管理。随机选择一行进行试验，剔除首尾两株，每处理选择连续3 株，当果实开始变软但未转色时（Eichhorn Lorenz 34，E-L 34）[15]，选择相同位置（东侧）、长势一致、无病虫害的果穗作为试验对象。
1.2 试验设计
1.2.1 筛选改善妮娜皇后着色与品质的处理措施试验开展于2022年6—8月，采用10种不同处理（详见表1）。选择6 月16 日傍晚（18:00—19:00）进行处理，所有喷施处理采用常规喷雾法，以喷清水作为对照（CK），每种处理中均添加1%吐温-80作为表面活性剂，果穗均匀喷雾，果粒均匀附着不滴水，试验过程中仅喷施处理1次。反光膜处理组果穗同样喷施清水+1%吐温-80以消除系统误差，铺反光膜前去除杂草、枯枝等地面尖锐物，将反光膜平铺于地面，用地钉压膜，保持膜面平整且不易掀飞，膜与膜交界处采用卡扣固定。每组处理约30穗果穗，处理后进行挂牌标记。
表1 本研究对转色前妮娜皇后果穗实施的不同处理措施
Table 1 Different treatments carried out in this study on Nina Queen clusters before color change
注：有效成分摘自包装上的成分说明，各喷施处理（包括CK）均添加1%吐温-80 作为表面活性剂。
Note: The active ingredients are taken from the ingredient statement on the package, and 1% Tween-80 was added as a surfactant to each spray treatment(including CK).
编号No.T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 CK处理Treatment S-诱抗素Trans-abscisic acid果得乐Guodele茉莉酸甲酯Methyl jasmonate(MeJA)天润多彩Tianrunduocai金村秋Jinchunqiu乙烯利Ethrel爱多收Aiduoshou艾果龙Aiguolong反光膜Reflective film清水Water处理条件Processing condition稀释200倍Dilute 200×稀释1000倍Dilute 1000×50 mg·L-1稀释1000倍Dilute 1000×稀释2000倍Dilute 2000×稀释600倍Dilute 600×稀释4000倍Dilute 4000×稀释800倍Dilute 800×在树冠正下方距离果穗1.5 m的地面铺设与树冠外缘对齐的0.5 m宽的白色反光地布（1446B型，杜邦，美国）果穗喷施清水处理。0.5 m wide white reflective ground cloth(1446B,DuPont,USA)aligned with the outer edge of the canopy was laid on the ground 1.5 m from the cob directly below the canopy,and the clusters were sprayed with water treatment.生产厂商Manufacturer四川龙蟒福生科技有限责任公司Sichuan Lomon Bio.Technology Co.,Ltd益地国际农业（北京）有限公司Yidi International Agriculture(Beijing)Co.,Ltd北京索莱宝科技有限公司Beijing Solarbio Technology Co.,Ltd广州天润多彩生态农业有限公司Guangzhou Tianrun Colorful Ecological Agriculture Co.,Ltd南京禾稼春生物科技有限公司Nanjing Hejiachun Biotechnology Co.,Ltd四川国光农化有限公司Sichuan Guoguang Agrochemical Co.,Ltd旭化学工业（漳州）有限公司Asahi Chemical Industry(Zhangzhou)Co.,Ltd深圳五谷网络科技有限公司Shenzhen Wugu Network Technology Co.,Ltd有效成分Active ingredient 5%S-诱抗素5%Trans-abscisic acid C.M.F.S（高浓缩糖蜜发酵液）C.M.F.S(Highly concentrated molasses fermentation broth)95%茉莉酸甲酯95%MeJA氨基酸肥Amino acid fertiliser 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）5-aminolevulinic acid 40%乙烯利40%Ethrel硝酚钠Sodium nitphenol氨基酸肥Amino acid fertiliser，
1.2.2 样品采集 处理开始时取第一次样，记为DS0。所有处理开始后，每隔10 d拍照取样1次，直至果实完全成熟，共取4 次样，分别记为DS1～DS4。从5穗处理果穗的上、中、下部位各采集10粒果实，试验期间每穗果仅取一次样。拍照果穗进行标记，不参与取样。测定果实外观指标和果实硬度后，将果皮、果肉、种子分离后利用液氮速冻，储存于-80 ℃备用。
1.3 试验方法
1.3.1 果实外观指标（1）果穗着色等级。随机选5串果穗，参照李芳菲等[16]的方法进行评价。
（2）果实着色指数。从采集的果实中随机选取20 粒果实，用手持色差计（CR-400；Konica Minolta，日本）测定每个果实赤道部位4 个方位的色泽指标L、a、b，并计算色泽饱和度（chroma，C）、色调角（hue angle，h）和葡萄果实色泽指数（color index of red grape，CIRG），CIRG指数评价果实外观色泽的标准为：CIRG＜2 为黄绿，2≤CIRG＜4 为粉红，4≤CIRG＜5为红色，5≤CIRG＜6为深红，CIRG≥6为蓝黑色[17]。
（3）单果质量、纵横径、果形指数。从采集的果实中随机选取20 粒进行外观指标测定。单粒质量采用电子天平（DLX-A8；德力西，中国）测定，果实纵径、横径用0.01 mm 游标卡尺（3.0V；德力西，中国）测定。果形指数=果实纵径/果实横径。
1.3.2 果实理化指标（1）果实硬度。选取20粒果实，采用数显式拉力计（HG-2000；Grows，中国）测定拉力计探头刺破果皮时的拉力数值。
（2）总花色苷含量。参考赵益梅等[18]的方法，采用pH示差法测定，随机选取20粒果实，冷冻状态下迅速将果皮和果肉分离，加液氮研磨成粉状，每个处理样品取3份进行提取和测定。
（3）总可溶性固形物（Total soluble solid，TSS）含量。选取20 粒果实，使用手持式折光仪（PAL-36S；ATAGO，日本）测定。
（4）可溶性糖和有机酸含量。将上一步中获得的果肉利用液氮研磨成粉状，提取方法和色谱条件均参考自Zheng 等[19]，采用超高效液相色谱（Ultraperformance liquid chromatography，UPLC；可溶性糖：ACQUITY H-Class，Water，美国；有机酸：Ulti-Mate 3000，Thermo，美国）测定果肉中可溶性糖和有机酸含量，每个处理样品取3份进行提取和测定。
（5）挥发性有机物含量（Volatile organic compounds，VOCs）。葡萄果实VOCs的提取采用顶空固相微萃取（HS-SPME）技术，测定的条件与方法参考Zhang等[20]的报道。每个处理样品取3份进行测定。
1.4 果实品质综合评价
选取与品质关系密切的13个指标，采用隶属函数法[21]进行果实品质综合评价。
（1）与果实品质呈正相关的指标为果穗着色等级、色泽指数、单果质量、纵径、横径、果实硬度，以及果皮总花色苷、TSS、总可溶性糖、果实香气（包括总VOCs、酯类和萜烯类）含量，计算如下式。
（2）与果实品质呈负相关的指标为总有机酸含量，计算如下式。
式中，U（Xij）表示各指标的隶属度值，且U（Xij）∈[0,1]；Xij表示第i 个处理第j 个指标的测定值；Xmax、Xmin为所有品种第j项指标的最大值和最小值。以不同处理的13 项指标隶属度的平均值作为妮娜皇后果实品质的评价标准进行比较。
1.5 RNA提取与荧光定量PCR
采用Biofit RNA提取试剂盒（V1.5，成都百菲特科技有限公司，中国）提取葡萄果皮RNA。RNA 反转录采用Hifair® Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（翌圣生物科技有限公司，中国）。RT-qPCR 采用Hieff Unicon® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix（翌圣生物科技有限公司，中国），具体方法参照说明书。每个处理样品取3 份，分别开展RNA 提取、反转录和RT-qPCR，其中RT-qPCR 同时采用3 次技术重复。VvUBQ 被用作内参基因，各基因的定量水平采用2-△△Ct方法计算，以CK 样品在DS0阶段时该基因的表达水平作为参照。本研究中所用基因的登录号及定量引物如表2所示。
表2 实时荧光定量PCR 引物序列
Table 2 RT-qPCR primer sequences
基因名称Gene name VvCHS VvUFGT VvDFR VvMYB90 VvUBQ基因编号Gene ID X75969.1 KJ495698.1 NM_001281215.2 XM_010666609.2 XR_002030723.1上游引物序列Forward primer sequence AAACTATGTGCTACAGTCC GGGATGGTAATGGCTGTGG GAAACCTGTAGATGGCAGGA TAGTCACCACTTCAAAAAGG GAGGGTCGTCAGGATTTGGA下游引物序列Reverse primer sequence GACTACAGTTCAGAAATAA ACATGGGTGGAGAGTGAGTT GGCCAAATCAAACTACCAGA GAATGTGTTTGGGGTTTATC GCCCTGCACTTACCATCTTTAAG
1.6 数据分析
采用软件SAS 9.2（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）进行统计学分析。采用Duncan多重比较检验（p＜0.05）分析显著性水平。
2 结果与分析
2.1 不同处理果实外观性状的变化
2.1.1 果穗着色程度 由图1-A 可知，各处理方式中除T7和T8外，其他处理均较CK更能够促进妮娜皇后果实着色，其中T1 促进果实着色的能力最强。在DS3时T1着色等级便已达到了4.85，显著高于其他处理和CK；此时T2和T3处理的果穗着色等级分别为3.85 和3.95，但同样显著高于其他处理；T4、T5、T6 和T9 处理分别为2.98、2.97、2.45 和2.45，其中T4和T5处理显著高于T6和T9处理；而T7、T8和CK则仅有1.75、1.85和1.65，3个处理间不存在显著性差异。至DS4时，T1、T2、T3处理的果穗着色等级均已达到5.00，即着色面积＞90%，T4、T5和T6处理在此时着色等级也接近5.00，分别为4.74、4.56 和4.32。T9 处理虽仅为3.25，但显著高于T7、T8 和CK，分别为2.65、2.77 和2.48，此3 个处理间不存在显著性差异（图1-B）。
图1 不同处理妮娜皇后果穗着色情况（A）与着色等级（B）的变化
Fig.1 Changes in coloration(A)and coloration level(B)of Queen Nina after different treatments
通过果实着色指数进一步比较，发现随着妮娜皇后果实逐渐成熟，L 和b 的指数逐渐减小，而a 和CIRG 增加，但不同处理的果实着色指数增加或减少的幅度存在差异。在DS1 时，各处理的L 值均显著低于CK。至DS2 时，与CK 相比，T7、T8 和T9 处理未表现出显著差异，而其他处理显著低于CK。在DS4时，T8和T9处理与CK差异不显著，T1和T2处理则相对较低，表明此处理使得果皮色泽最深。T7、T8、T9 和CK 的b 值在各个时期的差异相对较小，由DS0 的10.00～10.45 降至DS4 时的5.00～5.79，而其他处理在DS4时彼此间无显著差异，但显著低于这4 种处理，降至了1.28～2.89。CK 的a 值在DS0～DS3 期间均为负值，仅在DS4 达到了3.06，而T1 和T2 处理在DS1 时便为正值，分别为1.37 和0.44，且显著高于其他处理。在DS4时，与CK相比，T7、T8 和T9 处理的a 值也未表现出显著差异，而其他处理同样显著高于CK。
此外，T1处理的CIRG值在各个时期（DS1～DS4）均为各处理的最高值，且在DS3 时便已达到了深红的标准（5.52），并显著高于其他处理，T2 和T3 处理也达到红色标准，分别为4.68 和4.20，而此时CK 依旧仅处于黄绿色标准（1.87），且显著低于其他处理。在DS4时，除CK外，各处理的果实外观色泽标准与DS3 时保持一致，而CK 的CIRG 值达到了2.76，为粉红色（表3）。
表3 不同处理对妮娜皇后果实着色指数的影响
Table 3 Effect of different treatments on CIRG of Queen Nina berry
注：不同小写字母表示不同处理在0.05 水平差异显著。下同。
Note: Different small letters indicate significant differences among different treatments at 0.05 level. The same below.
CK 47.69±3.99 a 46.77±2.23 a 43.12±1.80 a 40.91±2.41 a 39.13±2.72 a-1.99±0.44 a-2.28±0.90 b-2.34±0.52 d-0.33±1.73 d 3.06±1.58 b 10.00±0.80 a 9.03±0.86 a 7.94±1.49 a 4.62±0.38 b 5.00±1.42 a 1.43±0.14 a 1.56±0.17 c 1.62±0.34 c 1.87±0.47 e 2.76±0.74 c T9 47.19±1.50 a 43.85±1.25 b 41.25±1.30 a 38.20±2.84 b 38.25±1.60 a-1.72±0.42 a-1.59±0.45 ab-0.36±1.26 d 3.20±1.71 b 2.80±1.18 b 10.35±0.79 a 9.56±0.85 a 5.96±0.77 b 4.53±0.45 b 5.14±1.65 a 1.46±0.37 a 1.62±0.23 c 1.99±0.59 b 3.07±1.04 c 3.74±0.53 b T8 46.97±4.49 a 43.97±3.16 b 41.68±2.18 a 38.82±1.81 b 40.35±1.83 a-1.60±0.46 a-1.47±1.71 ab 1.88±1.43 c 1.63±1.56 c 2.63±1.60 b 10.05±0.80 a 9.63±0.40 a 6.74±0.07 b 6.55±0.78 a 5.79±1.17 a 1.53±0.10 a 1.51±0.24 c 2.30±0.46 b 2.46±0.59 d 2.25±0.71 c 43.69±2.31 b T7 47.50±3.91 a 41.71±2.42 a 37.64±2.36 b 37.13±2.17 b-1.84±0.35 a-1.50±1.18 ab 1.62±1.48 c 5.05±1.16 a 3.22±0.38 b 10.45±0.80 a 5.48±0.43 c 4.61±1.24 c 4.90±0.55 b 5.15±2.19 a 1.45±0.14 a 1.52±0.27 c 2.41±0.61 b 2.45±0.48 d 2.85±0.48 c T6 47.67±0.76 a 44.71±2.73 b 39.64±3.86 b 36.48±3.32 b 36.08±2.46 b-1.84±0.34 a-0.53±1.37 ab 5.16±0.99 a 4.72±1.41 a 4.47±1.08 a 10.00±0.80 a 8.54±1.06 b 6.89±0.55 b 3.80±0.92 c 2.09±2.03 b 1.47±0.08 a 1.63±0.24 c 2.71±0.71 b 3.40±0.62 c 3.87±0.47 b T5 47.48±2.84 a 43.27±1.87 b 39.75±3.32 b 37.19±0.95 b 35.23±1.06 b-1.83±0.56 a-0.67±1.50 ab 3.22±0.60 b 4.50±1.10 a 4.70±1.70 a 10.28±0.80 a 8.95±0.68 a 6.44±0.22 b 3.47±0.38 c 2.81±1.89 b 1.53±0.12 a 1.60±0.20 c 2.57±0.60 b 3.42±0.10 c 3.41±0.30 b T4 46.82±3.58 a 42.19±2.15 b 37.29±3.21 b 36.43±2.19 b 36.76±3.17 b-1.92±0.52 a-0.16±1.75 ab 4.75±0.22 a 4.89±1.61 a 5.30±1.54 a 10.12±0.79 a 7.73±0.60 b 3.35±0.53 d 3.34±0.39 c 2.21±2.24 b 1.54±0.04 a 1.78±0.22 b 3.10±0.78 a 3.54±0.56 c 3.67±0.65 b T3 47.59±4.37 a 44.20±2.21 b 37.56±1.89 b 33.76±1.23 c 34.95±3.88 b-1.90±0.30 a-0.69±1.56 ab 5.61±0.80 a 6.30±1.55 a 6.86±1.44 a 10.19±0.78 a 10.62±0.43 a 2.63±0.92 d 1.27±0.87 d 1.28±1.64 b 1.51±0.24 a 1.57±0.13 c 3.49±0.64 a 4.20±0.25 b 4.06±0.31 b Different treatments T2 46.73±4.52 a 43.62±2.66 b 36.62±2.54 b 31.37±2.21 c 27.93±5.29 c-1.75±0.32 a 0.44±1.61 ab 4.79±1.47 a 4.74±0.54 a 5.77±0.79 a 10.38±0.81 a 9.90±0.91 a 4.86±1.39 c 0.82±1.42 d 2.89±1.17 b 1.49±0.26 a 1.74±0.45 b 3.25±0.65 a 4.68±0.51 b 4.82±0.43 a式方理处同不T1 46.88±2.37 a 40.02±3.45 c 35.81±2.00 b 28.46±1.28 d 27.54±2.59 c-1.84±0.54 a 1.37±1.13 a 5.92±1.71 a 5.06±1.21 a 6.12±1.34 a 10.08±0.78 a 7.80±0.45 b 5.54±0.73 c 0.90±0.28 d 1.98±0.56 b 1.50±0.11 a 2.22±0.59 a 3.56±0.44 a 5.52±0.20 a 5.43±0.42 a取Sampling 期时样period DS0 DS1 DS2 DS3 DS4 DS0 DS1 DS2 DS3 DS4 DS0 DS1 DS2 DS3 DS4 DS0 DS1 DS2 DS3 DS4指Target标L a b CIRG
2.1.2 单粒质量 不同处理组从DS0至DS4单粒质量整体上呈增加趋势。至DS4时，T5、T7和T9处理相对较大，分别为14.77、14.79 和14.99 g，且从DS0至此时均增加了3.00 g，而T2和CK相对较小，分别为12.88和12.93 g，分别仅增加了1.45和1.00 g。此外，其他处理（T2除外）在DS4时的单粒质量同样大于CK，介于13.42～14.44 g之间（表4）。
表4 不同处理对妮娜皇后果实形态发生的影响
Table 4 Effect of different treatments on the morphogenesis of Queen Nina berry
CK 11.93 12.75 12.60 12.63 12.93 27.47±0.37 a 27.54±0.26 a 27.90±0.39 b 27.80±0.15 b 27.54±0.47 c 29.58±0.67 a 29.84±0.54 c 30.23±0.33 d 30.30±0.47 d 30.99±0.52 f 1.08±0.05 a 1.08±0.03 a 1.08±0.03 c 1.13±0.04 cd 1.13±0.04 cd T9 11.99 13.87 14.74 14.55 14.99 27.31±0.53 a 28.11±0.48 a 28.58±0.21 a 28.45±0.13 a 28.73±0.54 a 29.42±0.59 a 30.68±0.48 b 31.58±0.62 c 31.50±0.43 c 33.48±0.31 c 1.07±0.04 a 1.09±0.04 a 1.11±0.05 bc 1.15±0.06 c 1.16±0.04 c T8 12.19 13.49 13.65 13.62 14.19 27.50±0.20 a 27.42±0.43 a 28.48±0.38 a 28.63±0.15 a 28.07±0.30 b 29.16±0.18 a 30.18±0.42 b 32.38±0.49 b 32.57±0.93 b 32.21±0.56 d 1.08±0.04 a 1.11±0.03 a 1.13±0.06 b 1.18±0.07 c 1.19±0.05 c 12.76 T7 11.79 13.56 14.25 14.79 27.12±0.22 a 27.38±0.53 a 28.98±0.42 a 28.82±0.63 a 28.91±0.36 a 28.94±0.31 a 29.40±0.40 c 30.36±0.75 d 30.26±0.75 d 31.67±0.25 e 1.07±0.04 a 1.07±0.07 a 1.08±0.03 c 1.13±0.07 cd 1.14±0.04 c 1.07±0.04 a 1.06±0.07 a 1.12±0.01 b 1.28±0.04 b T6 11.60 12.58 13.20 13.23 13.60 27.70±0.56 a 28.00±0.59 a 28.68±0.35 a 28.50±0.22 a 28.47±0.20 ab 29.40±0.48 a 29.74±0.91 b 30.20±0.33 d 30.68±0.47 d 30.72±0.19 f 1.27±0.07 b 1.07±0.03 a 1.05±0.05 a 1.17±0.06 b 1.34±0.05 a T5 11.77 12.39 14.79 14.74 14.77 27.02±0.42 a 27.38±0.55 a 28.05±0.26 b 28.27±0.42 b 28.52±0.37 a 28.84±0.86 a 29.76±0.94 b 33.73±0.80 a 33.90±0.66 a 35.53±0.49 a 1.36±0.08 a 1.09±0.04 a 1.09±0.04 a 1.13±0.03 b 1.22±0.04 b T4 12.44 12.84 14.65 14.04 14.44 27.17±0.50 a 27.20±0.63 a 27.63±0.65 b 27.80±0.40 b 27.71±0.47 c 29.17±0.55 a 29.15±0.32 d 34.15±0.64 a 33.80±0.27 a 34.80±0.31 b 1.21±0.05 c 1.08±0.04 a 1.11±0.03 a 1.23±0.03 a 1.24±0.03 b Different treatments T3 11.83 12.59 13.11 14.00 13.83 27.14±0.35 a 27.30±0.66 a 27.24±0.47 b 27.40±0.27 b 27.82±0.21 c 29.31±0.55 a 31.78±0.78 a 31.75±0.52 c 32.45±0.36 b 33.49±0.46 c 1.18±0.03 c T2 11.43 11.39 12.25 13.21 12.88 27.22±0.22 a 27.50±0.20 a 27.76±0.23 b 27.75±0.27 b 27.70±0.22 c 29.45±0.28 a 29.65±0.43 c 29.10±0.43 e 28.10±0.38 e 30.85±0.25 f 1.09±0.06 a 1.11±0.06 a 1.15±0.03 b 1.15±0.04 c 1.15±0.03 c式方理处同不T1 11.42 12.00 13.11 13.34 13.42 27.40±0.23 a 27.50±0.27 a 27.75±0.37 b 27.78±0.40 b 27.64±0.21 c 29.16±0.41 a 30.38±0.13 b 30.38±0.54 d 30.80±0.18 d 30.68±0.46 f 1.09±0.04 a 1.11±0.06 a 1.10±0.04 c 1.10±0.03 d 1.11±0.05 d取Sampling 期时样period DS0 DS1 DS2 DS3 DS4 DS0 DS1 DS2 DS3 DS4 DS0 DS1 DS2 DS3 DS4 DS0 DS1 DS2 DS3 DS4指Target单Single grain mass/g量果Fruit shape index横Transverse diameter/mm纵Longitudinal diameter/mm数质指标粒径径形
2.1.3 纵横径与果形指数 各处理组中果实横径的变化与单果质量变化的趋势相似，即在DS4 时T5、T7 和T9 处理的横径显著大于其他处理（T6 除外），分别为28.52、28.91和28.73 mm，与DS0时相比分别增加了1.50、1.79和1.42 mm。而各个时期T1～T4处理与CK相比均无显著差异，其中CK果实横径的增加量极少，仅为0.07 mm（表4）。
果实纵径在处理后的变化不尽相同，其中T5处理的果实纵径在大部分时期均显著大于其他处理，并由28.84 mm增长至35.53 mm。T4处理增长幅度也相对较大，增加了5.63 mm。T1、T2、T6 处理在DS4 时与CK的纵径相比无显著差异，且显著小于其他处理，较DS0分别仅增加了1.52、1.40、1.32和1.41 mm（表4）。
由于纵横径的差异性变化势必导致各处理间果形指数存在差异，除T1 处理在各个时期保持在1.09～1.11 外，其他各处理和CK 的果形指数均呈现出增长趋势。CK的果形指数由1.08增加至1.13，在DS4 时仅显著低于T3～T6处理，其中T5的果形指数最大，为1.34，并显著高于T3、T4 和T6 处理，这3 个处理此时的果形指数分别为1.24、1.22和1.28（表4）。
2.2 不同处理果实理化性状的变化
2.2.1 果实硬度 各处理组中仅有T5 处理未随果实成熟进程果实硬度逐渐降低，其在DS4时依旧保持着1.54 kg·cm-2 的果皮拉力数值，与DS0 时的1.62 kg·cm-2相当，且显著高于其他处理。T9处理硬度变化也相对较小，仅由1.65 kg·cm-2降至1.42 kg·cm-2。与之相反，T1和T3处理在DS4时硬度相对较低且显著低于CK，分别仅为1.08 kg·cm-2和1.02 kg·cm-2。此外，与DS4 时CK 果实硬度的1.26 kg·cm-2相比，T2、T4、T6、T7、T8 处理的并未表现出显著差异，分别为1.20、1.28、1.22、1.22和1.28 kg·cm-2（图2）。
图2 不同处理对妮娜皇后果实硬度的影响
Fig.2 Effects of different treatments on fruit firmness of Queen Nina berry
2.2.2 果皮花色苷含量及相关基因表达的变化 不同处理后果皮中花色苷含量与CIRG值呈相似的变化趋势。在DS1时，T1处理的果皮中花色苷含量（w，后同）最高，为0.073 mg·g-1，此时CK仅为0.003 mg·g-1，其他处理也显著高于CK；DS1至DS2期间各组花色苷含量均大幅度增加，其中T1 和T2 处理含量增加最多，分别增加了0.16和0.15 mg·g-1，达到了0.23和0.19 mg·g-1，CK在DS2时的含量及增长量均显著低于各处理；DS2 至DS4 期间，各组花色苷积累放缓，其中T1 在DS3 和DS4 时含量差异较小，分别为0.29 和0.30 mg·g-1，且在DS4时与T2、T3和T4处理无显著差异，后三者此时含量分别为0.29、0.28 和0.29 mg·g-1，T5 和T6 处理虽不及T1～T4 的含量，但依旧显著高于CK，均为0.16 mg·g-1，T7、T9与CK差异不显著，三者含量分别为0.11、0.12和0.10 mg·g-1，而T8 处理果皮中花色苷含量甚至显著低于CK，仅有0.069 mg·g-1（图3）。
图3 不同处理对妮娜皇后果皮花色苷含量的影响
Fig.3 Effects of different treatments on the content of anthocyanin in Queen Nina skin
进一步比较了不同处理果皮中花色苷合成相关基因在DS0、DS2 和DS4 3 个时期的表达情况，发现VvCHS、VvUFGT、VvDFR和VvMYB90在不同处理后的变化趋势与花色苷含量相一致，即在DS2时，T1处理中4个基因的表达水平均为最高，而CK则显著低于其他处理；DS4时T1～T4处理后VvUFGT、VvDFR和VvMYB90表达水平相当且显著高于其他处理，而T7、T8和CK的表达水平则相对较低（图4）。
图4 不同处理对妮娜皇后果皮中花色苷合成相关基因的影响
Fig.4 Effects of different treatments on genes related to anthocyanin synthesis in Queen Nina skin
2.2.3 果实TSS 含量 随着果实逐渐成熟，果实中TSS含量亦逐渐增加，但不同处理间的差异性同花色苷和果皮色泽截然不同。例如花色苷积累较快的T1和T2处理在DS4时TSS含量与CK未表现出显著差异，分别为17.42%和17.28%，而此时CK为17.38%，但同样花色苷含量较多的T3、T4和T5处理则在DS1至DS4期间均显著高于CK，其中DS4时各处理含量分别为20.60%、20.66%和20.98%。此外，T6～T9 在大部分采样期较CK均未表现出显著的差异，在DS4时分别为16.84%、17.72%、17.70%和16.30%（图5）。
图5 不同处理对妮娜皇后果肉中可溶性固形物含量的影响
Fig.5 Effects of different treatments on the content of anthocyanin in Queen Nina flesh
2.2.4 果肉可溶性糖含量 妮娜皇后果肉中未检测到蔗糖，仅检测到葡萄糖和果糖2种可溶性糖，且两者含量相当。各处理果肉可溶性糖含量的变化趋势与TSS含量相似，即在DS0至DS2各处理果肉中总可溶性糖含量快速增加，但DS2至DS4变化幅度相对较小。其中在DS1时，T2～T5处理的总可溶性糖含量显著高于其他处理（T6除外），分别为109.94、113.47、101.52 和99.65 mg·g-1，而T7～T9 处理与CK 无显著差异，分别为74.07、76.31、74.21和69.60 mg·g-1。至DS2时，T2总可溶性糖含量较上一次采样时期仅增加了19.64 mg·g-1，达到了129.60 mg·g-1，与T6相当，仅显著高于T8、T9和CK，此时T3和T4处理显著高于其他处理，分别为171.82 和172.18 mg·g-1。在DS4时，T3～T5处理依旧显著高于其他处理，分别为180.40、190.33 和198.94 mg·g-1；其次为T6 和T7 处理，含量分别为150.61和150.51 mg·g-1；T1、T2和T8处理虽显著低于上述处理，但均显著高于CK；T9处理则显著低于CK，甚至低于其DS3 时的含量，仅为100.11 mg·g-1（图6）。
图6 不同处理对妮娜皇后果肉中可溶性糖（葡萄糖、果糖）含量的影响
Fig.6 Effects of different treatments on soluble sugar(glucose,fructose)content in Queen Nina flesh
2.2.5 果肉有机酸含量 检测妮娜皇后果肉中酒石酸、苹果酸和柠檬酸3种葡萄中主要的有机酸含量，其中苹果酸含量在果实成熟过程中逐渐减少，且在DS0与DS1时是果肉中含量最多的有机酸，而酒石酸和柠檬酸含量在各个取样期的变化相对较小，因此苹果酸含量决定了妮娜皇后果肉中总有机酸含量水平。在DS1时，T2、T5、T6、T9处理和CK中苹果酸的含量显著高于其他处理，分别为4.50、4.86、4.20、4.22和4.93 mg·g-1，但至DS2时，T5、T6、T7、T8处理和CK中苹果酸含量快速降低，且显著低于其他处理。而在DS4时，各处理组中苹果酸含量相对较低，仅介于0.04～0.37 mg·g-1，低于酒石酸和柠檬酸，此时各处理组总有机酸含量介于2.79～4.53 mg·g-1，其中T4处理含量相对较低，而其他处理与CK的含量差异较小（图7）。
图7 不同处理对妮娜皇后果肉中有机酸（酒石酸、苹果酸、柠檬酸）含量的影响
Fig.7 Effects of different treatments on the content of organic acid(tartaric,malic,and citric acid)in Queen Nina flesh
2.2.6 果肉中VOCs含量 香气亦是评判葡萄果实风味与品质性状的重要指标，因此通过GC-MS 测定了DS4时期果肉中酯、醛、烃、醇、萜烯、酮等VOCs的含量，其中妮娜皇后果肉中酯、醛、烃3类VOCs的含量相对较高。T1、T7和T9处理的VOCs含量略低于CK，分别为24.37、24.88、22.35和25.80 μg·g-1，各处理中T2的总VOCs最高，为32.87 μg·g-1，其烃类亦为各处理组中最高，为9.04 μg·g-1。萜烯作为重要气味和风味类物质，在T1、T2和T4处理中相对较高，分别为0.26、0.27和0.23μg·g-1，但其他处理却低于CK（图8-A）。
图8 不同处理对妮娜皇后果肉中挥发性有机物含量的影响
Fig.8 Effects of different treatments on the content of VOCs in Queen Nina flesh
从不同VOCs 来分析，乙酸乙酯是妮娜皇后果肉中含量最高的VOCs，其中在T2～T8 处理中的含量介于14.71～17.40 μg·g-1，显著高于CK，而T1和T9分别仅有9.40 和11.34 μg·g-1，显著低于CK（图8-B）；丁酸乙酯在CK中的含量为1.73 μg·g-1，仅有T8显著高于CK，为2.27 μg·g-1，T1、T3 和T7 处理则显著低于CK，分别为0.84、0.71 和0.85 μg·g-1，而其他处理组的含量与CK相当（图8-C）；顺-2-丁烯酸乙酯含量仅在T1和T2处理中与CK相当，其他处理均显著高于CK（图8-D）；T3 和T8 处理中己醛含量以及T1、T2 和T6 处理中甲苯含量均显著高于CK（图8-E～F）；反式-2-己烯醇是妮娜皇后果肉含量最高的萜烯类物质，在T1、T2和T4处理中显著高于其他处理和CK，分别为0.23、0.22和0.23 μg·g-1（图8-G）。
2.3 不同浓度处理果实品质的综合评价
对不同处理妮娜皇后果实在DS1～DS4 多个性状表现进行综合评价，发现各处理组隶属度函数值的平均值均大于CK 的0.22，其中T3、T4 和T5 处理相对较大，分别为0.61、0.59和0.58。决定果实成熟与采摘时性状的DS4 时期隶属度函数值，T3、T4 和T5 处理同样相对较高，分别为0.62、0.75 和0.69（表5）。在此时期T3 处理仅有果实硬度为0，其在着色等级以及TSS、花色苷、可溶性糖以及酯类含量的函数值在各处理中相对较高，T4 和T5 处理则在果实大小性状（包括单果质量和纵径）、硬度、可溶性糖含量的函数值高于T3处理（表6）。
表5 不同处理促进妮娜皇后果实品质形成的隶属度函数值
Table 5 Subordination degree related to Queen Nina fruit quality traits after different treatments
处理Treatment T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 CK取样时期Sampling period DS1 0.55 0.41 0.59 0.32 0.32 0.40 0.23 0.25 0.40 0.24 DS2 0.47 0.34 0.57 0.63 0.61 0.47 0.41 0.39 0.41 0.25 DS3 0.53 0.44 0.66 0.65 0.72 0.44 0.42 0.44 0.41 0.14 DS4 0.42 0.53 0.62 0.75 0.69 0.42 0.42 0.37 0.41 0.23平均值Average 0.49 0.43 0.61 0.59 0.58 0.43 0.37 0.36 0.41 0.22
表6 不同处理后在DS4 时果实品质性状相关的隶属度函数值
Table 6 Subordination degree related to fruit quality traits at DS4 after different treatments
处理Treatment T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 CK着色等级Coloration level 1.00 1.00 1.00 0.90 0.83 0.73 0.07 0.12 0.31 0.00 CIRG 1.00 0.81 0.57 0.45 0.36 0.51 0.19 0.00 0.47 0.16单果质量Single fruit mass 0.26 0.00 0.45 0.74 0.90 0.34 0.91 0.62 1.00 0.02横径Longitudinal diameter 0.07 0.12 0.20 0.12 0.72 0.68 1.00 0.39 0.87 0.00纵径Horizontal diameter 0.00 0.04 0.58 0.85 1.00 0.01 0.20 0.32 0.58 0.06硬度Fruit hardness content 0.12 0.35 0.00 0.50 1.00 0.38 0.38 0.50 0.77 0.46可溶性固形物含量Total soluble solid content 0.24 0.21 0.92 0.93 1.00 0.12 0.30 0.30 0.00 0.23花色苷含量Anthocyanin content 1.00 0.98 0.92 0.95 0.38 0.41 0.17 0.00 0.22 0.16可溶性糖含量Soluble sugar content 0.36 0.33 0.87 0.91 1.00 0.51 0.51 0.31 0.00 0.17有机酸含量Organic acid content 0.25 0.28 0.58 1.00 0.00 0.59 0.47 0.43 0.65 0.32挥发性有机物含量Volatile organic compounds(VOC)content 0.19 1.00 0.75 0.65 0.74 0.43 0.24 0.65 0.00 0.33酯含量Esters content 0.00 0.75 0.92 0.88 1.00 0.74 0.60 0.79 0.30 0.60萜烯含量Terpenes content 0.97 1.00 0.36 0.88 0.00 0.02 0.47 0.40 0.16 0.50
3 讨 论
光照环境、昼夜温差、品种特性等诸多因素均会影响葡萄果实着色[22-24]，而南方避雨棚内光照不足与转色期昼夜温差小，是导致具有诸多优良性状的妮娜皇后在部分南方产区着色不良、糖分积累缓慢等问题的潜在环境因素[25]，极大限制了该品种在此地区的推广。为此，笔者在本研究中通过在果实表面喷施植物生长调节剂（S-诱抗素、茉莉酸甲酯、乙烯利）、氨基酸肥（天润多彩、金村秋、艾果龙）、叶面肥（果得乐、爱多收）以及铺设反光膜等多种栽培措施，并比较了不同栽培措施下果实外观和品质性状的阶段性变化差异。而葡萄优质果是由果皮色泽、果实含糖量、形状、粒质量、香气等诸多外观与品质指标综合评定的模糊集合[26]，隶属度函数值能够通过描述不同性状对果实品质的隶属关系，并在综合分析果实品质性状中广泛应用[21，27-28]。在本研究中，同样通过隶属度函数值综合分析了不同栽培措施对妮娜皇后果实品质性状提升效果的优劣，并筛选出喷施50 mg·L-1茉莉酸甲酯是改善妮娜皇后葡萄果实着色与品质的最佳处理方式。
从果实外观性状来看，S-诱抗素和茉莉酸甲酯两类植物生长调节剂均能够有效且快速地提高花色苷合成相关基因VvCHS、VvUFGT、VvDFR 和VvMYB90 的表达水平，改善果实着色，提升果皮中花色苷含量，但对果实大小的影响有限。尽管乙烯利也能有效促进果实着色，但其效果远不及另两种植物生长调节剂，这可能与葡萄作为非呼吸跃变性果实，对乙烯的敏感性不如ABA 有关[29-30]。令人欣喜的是以浓缩糖蜜发酵液作为主要有效成分的“果得乐”，表现出与S-诱抗素和茉莉酸甲酯类似的效果，而利用外源蔗糖处理桃、蓝莓、草莓等果实同样也可以提高果实着色水平[31-33]，这与糖信号通路能够激活花色苷生物合成通路相关[34-35]。氨基酸肥和叶面肥不仅能够促进果实着色，在增加果粒大小方面的作用也尤为显著，其中天润多彩和金村秋的效果最为显著，后者以5-ALA 作为主要有效成分，已在多种果树中证实具有类似植物生长调节剂的作用，并能够改善果实品质[36-38]。此外，本研究结果表明反光膜对促进果实着色的作用有限，尽管已有研究表明，光是诱导葡萄果皮花色苷积累的重要环境因子[20]，李志强等[39]、Zhang 等[40]和Muneer 等[41]也证实了反光膜能够促进果皮着色、改善果实品质，本研究的结果可能因试验地选择了郁闭度较高的飞鸟架，且行间未留有足够的空隙，导致通过地膜反射给果实的光不足以改善果实着色，并最终导致其在改善果实着色与品质的效果方面不尽如人意。
此外，本研究所使用的大部分药剂已商品化且容易购买，且参照说明书中推荐剂量，旨在比较当下主流改善果实品质药剂对妮娜皇后的作用，并通过试验的结果指导葡萄生产者选择使用有效的药剂。其中茉莉酸甲酯、天润多彩和金村秋在增加果肉中可溶性糖和VOCs 含量、降低有机酸含量方面具有显著作用，3 种处理在各时期的隶属度函数平均值均相对较高，结合作者在前期筛选发现50 mg·L-1茉莉酸甲酯可作为南方部分产区解决妮娜皇后果实着色不佳问题的喷施药剂[6]，天润多彩和金村秋同样也能够作为有效的喷施药剂改善妮娜皇后果实着色与品质。此外，S-诱抗素因具有促进葡萄果皮快速上色的特点，也可应用于改善果实着色，而筛选其与茉莉酸甲酯、天润多彩和金村秋的不同浓度配比，共同作用于改善果皮着色与提升果实品质，将是下一步的研究方向。
4 结 论
S-诱抗素改善妮娜皇后葡萄果实着色的效果最佳，但增加果肉中可溶性糖和VOCs 含量的效果有限。茉莉酸甲酯不仅能够改善果实着色，促进VvCHS、VvUFGT、VvDFR和VvMYB90花色苷合成相关基因的表达，还可提高TSS、可溶性糖、VOCs含量以及降低有机酸含量。此外，金村秋和反光膜处理在增加果实纵横径和硬度方面具有显著的作用。通过运用隶属函数法对所有处理进行综合评价分析，表明50 mg·L-1茉莉酸甲酯是笔者在本研究中改善妮娜皇后葡萄果实着色与品质的最佳处理方式。
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