蜂糖李是由贵州省安顺市农业科学院等单位从安顺市镇宁县地方李品种中选育出的优质中国李品种，口感脆嫩，入口化渣，风味独特，无酸涩苦味，是李中珍品[1]。近年来，由于蜂糖李市场行情持续向好，其栽培生产规模不断扩大，对优质纯正种苗的需求也急剧增加，导致蜂糖李苗木市场出现了一些以次充好、以假乱真的问题；在果实成熟季节，还存在着外观与蜂糖李相似，但口感相差甚远的四月李等地方李品种，冒充蜂糖李出售的现象，扰乱了蜂糖李的生产和销售秩序。此外，蜂糖李中还存在着一定程度的品系混杂问题，在果实品质、果皮颜色、叶片形态、树体产量等方面出现了不同类型的变异。根据成熟时果皮颜色的差异，发现有黄皮蜂糖李（成熟时果皮为黄色）、青皮蜂糖李（成熟时果皮为绿色）、一点红蜂糖李（成熟时靠近果柄的部位出现不规则片状红色）等品系，他们在果实品质、配套栽培管理技术方面也存在一定程度的差异；品系的混杂会给生产中果园标准化管理、果实采摘和果品分级等方面带来一定的不便，影响果园的综合经济效益。因此，鉴定和区分蜂糖李以及蜂糖李品种内的品系类型，对蜂糖李产业的标准化和品质提升至关重要。为了蜂糖李产业的可持续发展，寻找有效方法进行蜂糖李种质鉴定，区分蜂糖李内自然变异的群体以及与其他李种质之间的差异具有重要意义。
在种质分类与鉴定中，常用的方法包括形态学标记、孢粉等方面的微形态标记、同工酶与分子标记等[2]。植物花粉的形态特征通常相对稳定，携带丰富的遗传信息，因此对花粉外观的研究已经成为常见的种质鉴定和植物分类方法，在果树、蔬菜、花卉等各类园艺作物中有广泛的应用[3-5]。分子标记在基因水平上标记遗传差异，不受组织、器官或环境的影响，在果树种质鉴定中也得到广泛应用。随着测序技术的发展，分子标记已发展至第三代，其中SSR等第二代分子标记在李的种质鉴定中应用较为广泛[6-7]。InDel分子标记作为第三代分子标记，通过检测基因组中核苷酸片段的插入和缺失而开发，具有条带清晰、稳定性强以及经济便捷等特点。在柚[8]、乌菜[9]、辣椒[10]等园艺作物的种质鉴定中已有成功应用，然而在中国李种质鉴定与分类中还未见报道。开发更多类型的分子标记对完善蜂糖李的鉴别体系具有非常重要的作用。
笔者选择了黄皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一点红蜂糖李这3 种成熟时果实表皮颜色不同的蜂糖李品系、6 个蜂糖李原产地贵州安顺市的本地李种质（蜜李1 号、安顺本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打帮李、冰脆李），以及3 个其他地区的李种质（台湾蜜李、三月李、三华李）作为试验材料，结合孢粉学和InDel分子标记技术，分析蜂糖李与其他李种质在花粉形态和基因层面上的差异，并利用另外来自不同区域的12 个代表性的李品种对筛选到的分子标记进行进一步验证，同时寻找蜂糖李3 个品系之间的差异，以期为蜂糖李的种质鉴定和未来的育种工作提供孢粉学与分子层面的依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
笔者选取的试验材料主要来源于贵州省安顺市农业科学院与广东省广州市华南农业大学所属的李种质资源圃。12 份李种质涵盖了黄皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一点红蜂糖李、蜜李1 号、安顺本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打帮李、冰脆李、台湾蜜李、三月李及三华李，这些被用于进行孢粉学分析和分子标记试验，具体信息详见表1。上述种质的果实成熟期表型详见图1。此外，为了验证分子标记的准确性，收集了包括粉黛脆李、凤凰李、脆红李、国峰7号、大红袍、黄干核李、岭溪李、檇李、黄金奈李、恐龙蛋、味帝及紫叶李等在内的另外12份李种质材料。
图1 供试种质成熟果实侧视图与纵切图
Fig.1 Side view and longitudinal section of mature fruits for trial germplasms
表1 蜂糖李和其他李种质信息
Table 1 Information on Fengtangli and other plum germplasms
序号No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12种质名称Germplasm name黄皮蜂糖李Huangpifengtangli青皮蜂糖李Qingpifengtangli一点红蜂糖李Yidianhongfengtangli蜜李1号Mili No.1安顺本地晚熟李Anshunbendiwanshuli晚熟青脆李Wanshuqincuili四月李Siyueli打帮李Dabangli冰脆李Bingcuili台湾蜜李Taiwanmili三月李Sanyueli三华李Sanhuali采集地Collection location贵州省安顺市镇宁县Zhennin County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市镇宁县Zhennin County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市关岭县Guanling County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市普定县Puding County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市普定县Puding County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市普定县Puding County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市镇宁县Zhennin County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市镇宁县Zhennin County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市紫云县Ziyun County，Anshun City，Guizhou Province贵州省安顺市普定县Puding County，Anshun City，Guizhou Province广东省广州市从化区Conghua District，Guangzhou City，Guangdong Province广东省信宜市钱排镇Qianpai Town，Xinyi City，Guangdong Province种质类型Germplasm types贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm贵州本地李种质Guizhou local plum germplasm引进李种质Introduction of plum germplasm广东本地李种质Guangdong local plum germplasm广东本地李种质Guangdong local plum germplasm
1.2 花粉的收集与微观形态观察
选择果园内5 年生果树，待其花蕾膨大为铃铛状、雌雄蕊未显露、花朵即将开放时，即大蕾期，采摘花蕾。用干净的镊子小心去掉花瓣和花萼，收集花药，将花药平铺在硫酸纸上自然阴干48 h，待花粉散出后，收集花粉存放于1.5 mL 离心管中，在离心管中加入少数硅胶粒使花粉保持干燥，常温存放。
将花粉均匀散布在贴有双面胶的样品台上，在真空状态下使用离子溅射仪（HITACHI，MC1000，日本）进行喷金处理，并置于扫描电子显微镜（HITACHI，SU8100，日本）下进行观测，选择具有代表性的极面和赤道面视野拍照，并观察局部的形态与纹饰特征。
1.3 DNA提取与重测序
采集供试李种质的幼嫩叶片，采用改良版的CTAB 法提取黄皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一点红蜂糖李、蜜李1 号、安顺本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打帮李的DNA[11]。使用超声波法将DNA 片段化，并对处理后的片段DNA 进行纯化、末端修复、3'端加A、连接测序接头，构建文库，再利用Illumina平台进行测序，将原始数据过滤后得到Clean reads，将数据对比到已发表的三月李参考基因组（https://www.rosaceae.org/Analysis/9450778）上，并使用BWA软件将Clean reads 与参考基因组序列对比，上述的重测序工作由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
1.4 InDel位点筛选与引物设计
使用Genome Analysis Toolkit（GATK）v3.8 软件对InDel位点进行初步预测，后使用基因组可视化工具Integrative Genomics Viewer（IGV）v2.12.3 软件进行精细筛选，筛选蜂糖李中特异的InDel 位点（图2），记录差异区域的具体位置信息。使用TBtools-Ⅱv2.0软件中的Fasta Extract功能，提取差异区域上下游大约1 kb 的序列。利用Primer Premier 5.0 软件，在差异区域上下游位置设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
图2 IGV 中筛选出的符合标准的InDel 位点
Fig.2 InDel sites filtered in IGV according to criteria
1.黄皮蜂糖李；2.青皮蜂糖李；3.一点红蜂糖李；4.蜜李1 号；5.安顺本地晚熟李；6.晚熟青脆李；7.四月李；8.打帮李。
1.Huangpifengtangli;2.Qingpifengtangli;3.Yidianhongfengtangli;4.Mili No.1;5.Anshunbendiwanshuli;6.Wanshuqingcuili;7.Siyueli;8.Dabangli.
1.5 InDel标记检测
使用江苏康为世纪生物科技股份有限公司的2×Flash PCR MasterMix（Dye）作为PCR 反应试剂。PCR扩增体系（20 μL）：10 μL 2×Flash PCR MasterMix（Dye），0.8 μL Forward Primer（10 μmol·L-1），0.8 μL Reverse Primer（10 μmol·L-1），1 μL 模板DNA（质量浓度20~60 ng·μL-1），7.4 μL ddH2O。扩增程序为：98 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸7 s，34 次循环，72 ℃延伸1 min。PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 数据分析
使用Image J v2.9.0 软件分析花粉的极轴长、赤道轴长、花粉粒形状、花粉大小、条脊宽、沟脊宽和网孔密度等形态指标数据（n=10）。花粉形态描述主要参考《孢粉学手册》[12]，花粉粒形状按极赤比（P/E）划分，P/E＞2 为超长球形，2≥P/E＞1.14 为长球形。使用SPSS 22.0 进行单因素方差分析和聚类分析。在单因素方差分析中，采用Duncan’s 法进行差异比较，对花粉数据应用平均连锁法，并基于欧氏距离进行聚类分析。使用Photoshop 2021 软件对图像进行标注和组图处理。
2 结果与分析
2.1 花粉微观形态特征
2.1.1 极性、对称类型及萌发器官 如图3 所示，所有供试材料的花粉粒均为单粒花粉，花粉的赤道面均可将其分割为对称的两部分，即花粉为等极。花粉均具有4 个对称面，呈辐射对称，并且具有3 个环状孔沟，三沟均匀垂直于赤道分布。根据NPC 分类系统[12]，所有供试材料的花粉均属于N3P4C5型。
图3 花粉形态与外壁纹饰
Fig.3 Pollen morphology and exine ornamentation
2.1.2 形状及大小 所有供试材料花粉的极面观均为三裂圆形，赤面观均为长椭圆形，但种质间的极轴与赤道轴长度存在一定差距。由表2 可知，所有花粉的极轴长度为36.64~44.83 μm，均值40.91 μm，根据Erdtman[12]的花粉大小分类标准，本研究中的所有供试材料的花粉均属于中等大小（25~50 μm）。但四月李的花粉极轴长度为36.64 μm，显著小于其他李种质；三月李的花粉极轴长度为44.83 μm，在供试材料中最长；两者与蜂糖李花粉在极轴长度上差距较大。黄皮、青皮和一点红蜂糖李的花粉极轴长度相似，三者的极轴长平均值约为40.51 μm。
表2 花粉大小与形态特征
Table 2 Pollen size and morphological characteristics
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。下同。
Note:Different small letters in the same column indicate significant difference(p＜0.05).The same below.
种质名称Germplasm name极赤比P/E花粉形状Shape of pollen极面观Polar view赤面观Equatorial view黄皮蜂糖李Huangpifengtangli青皮蜂糖李Qingpifengtangli一点红蜂糖李Yidianhongfengtangli蜜李1号Mili No.1安顺本地晚熟李Anshunbendiwanshuli晚熟青脆李Wanshuqincuili四月李Siyueli打帮李Dabangli冰脆李Bingcuili台湾蜜李Taiwanmili三月李Sanyueli三华李Sanhuali花粉大小Pollen size/μm极轴长Polar axis length 40.80±2.22 bc赤道轴长Equatorial axis length 22.75±0.48 ab 长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse长椭圆形Elongate ellipse 1.91±0.23 abcd 40.63±0.92 bc 22.61±0.38 ab 1.83±0.07 cd 40.09±1.47 bc 23.16±0.32 a 1.80±0.11 d 41.96±1.89 abc 19.97±0.64 d 2.02±0.20 abc 40.75±3.44 bc 22.53±0.42 ab 1.82±0.17 cd 40.78±3.99 bc 20.53±1.09 d 2.07±0.18 ab 36.64±2.04 d 20.46±0.55 d 1.77±0.12 d 40.56±1.75 bc 22.92±0.66 a 1.95±0.22 abcd 39.66±1.33 c 22.19±0.56 b 1.86±0.22 bcd 41.43±2.42 bc 22.89±0.43 ab 1.85±0.20 cd 44.83±1.97 a 21.32±0.57 c 2.11±0.17 a 42.80±4.91 ab 23.11±0.84 a 1.92±0.30 abcd长球形Prolate长球形Prolate长球形Prolate超长球形Perprolate长球形Prolate超长球形Perprolate长球形Prolate长球形Prolate长球形Prolate长球形Prolate超长球形Perprolate长球形Prolate三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular三裂圆形Trifid circular
所有供试材料花粉的赤道轴长度平均值为22.04 μm，不同李种质的花粉在赤道轴上差距较大，蜜李1 号、晚熟青脆李、四月李、三月李的赤道轴长度小于蜂糖李与其他李种质。在蜂糖李中，一点红蜂糖李的花粉赤道轴稍长于黄皮与青皮蜂糖李。根据极赤比划分花粉形状，除蜜李1 号、晚熟青脆李、三月李为超长球形外（P/E＞2），蜂糖李与其他李种质皆为长球形（2≥P/E＞1.14）。
2.1.3 外壁纹饰 供试李种质的外壁纹饰均为“条纹-穿孔”，即由条纹与穿孔组成，条脊大部分接近纵向平行排列，但不同种质在条纹与穿孔细节上存在较大差异，例如条纹走向、条纹疏密程度、孔频等（表3）。
在蜂糖李的3 个品系中，花粉差异主要体现在外壁纹饰特征上。黄皮蜂糖李的脊宽相对较大，而青皮蜂糖李与一点红蜂糖李的脊宽数值相近，三者在脊间距方面差异相对较小。此外，在蜂糖李的3个品系中，一点红蜂糖李的孔频显著小于其他两个品系，孔径显著小于青皮蜂糖李，与黄皮蜂糖李差异不显著。蜂糖李与其他供试种质在外壁纹饰特征上也存在较大差异。蜜李1 号、冰脆李和三华李的脊宽相对较小，而安顺本地晚熟李、台湾蜜李和三月李的脊宽较大，上述6 个种质在脊宽上与蜂糖李存在显著差异。此外，安顺本地晚熟李在脊间距上显著大于其他供试李种质，而四月李则小于其他李种质。
表3 花粉外壁纹饰特征
Table 3 Pollen exine ornamentation characteristics
种质名称Germplasm name黄皮蜂糖李Huangpifengtangli青皮蜂糖李Qingpifengtangli一点红蜂糖李Yidianhongfengtangli蜜李1号Mili No.1安顺本地晚熟李Anshunbendiwanshuli晚熟青脆李Wanshuqincuili四月李Siyueli打帮李Dabangli冰脆李Bingcuili台湾蜜李Taiwanmili三月李Sanyueli三华李Sanhuali脊宽Ridge width/μm 0.28±0.04 c 0.26±0.03 cd 0.25±0.06 cd 0.20±0.03 ef 0.39±0.05 a 0.26±0.02 cd 0.23±0.06 de 0.23±0.02 de 0.20±0.03 ef 0.33±0.07 b 0.37±0.06 ab 0.18±0.03 f脊间距Distance between ridges/μm 0.22±0.04 bc 0.21±0.04 bcd 0.19±0.05 bcde 0.20±0.02 bcd 0.35±0.04 a 0.23±0.03 b 0.15±0.03 e 0.19±0.04 bcde 0.19±0.04 cde 0.22±0.07 bc 0.20±0.02 bcd 0.18±0.04 de孔径Aperture/μm 0.20±0.03 ab 0.23±0.04 a 0.16±0.04 bc 0.20±0.04 ab 0.25±0.03 a 0.15±0.02 bc 0.14±0.02 c 0.25±0.06 a 0.20±0.04 ab 0.16±0.03 bc 0.25±0.03 a 0.22±0.05 a孔频Porosity/（No.·μm-2）1.27±0.04 d 1.25±0.05 d 0.92±0.02 f 2.33±0.06 a 0.76±0.01 g 1.07±0.04 e 1.95±0.01 b 0.91±0.04 f 0.81±0.01 g 1.37±0.01 c 1.02±0.03 e 1.26±0.02 d外壁纹饰类型Types of exine ornamentation条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate条纹-穿孔Striate-perforate
2.1.4 聚类分析结果 根据极轴长、赤道轴长、极赤比、花粉形状、脊宽、脊间距、孔径、孔频等8项指标，对供试李种质的孢粉数据进行聚类分析。其中，花粉形状作为描述性特征，因而在聚类分析中将其数字化，长球形与超长球形分别编号为0与1。聚类分析结果如图4所示，显示了花粉的相似度，同时有助于确定不同种质之间的亲缘关系。
图4 花粉形态数据欧式距离聚类分析
Fig.4 Clustering analysis of pollen morphology data based on Euclidean distance
在欧氏平方距离为20 时，供试的李种质被划分为两大组，其中四月李独立成一组。而在欧氏平方距离为15 时，供试的李种质被划分为三大组，四月李和三月李被分开，表明他们的花粉形态与蜂糖李存在较大差异，亲缘关系可能较远。与此同时，3 个蜂糖李品系与打帮李、安顺本地晚熟李、台湾蜜李被聚为最小的一支，这说明他们的花粉形态相似。
2.2 蜂糖李分子标记开发与筛选
笔者在本研究中设计并使用了多对引物用于蜂糖李分子标记的开发与筛选，最终筛选到2 对引物用于鉴别蜂糖李，他们在本研究的12 个李种质中均成功扩增出目标条带，引物序列如表4所示。
表4 InDel 标记引物信息
Table 4 InDel marker primer information
引物名称Primer name P1-21-F P1-21-R P4-46-F P4-46-R P3-38-F P3-38-R引物序列Primer sequences(5'-3')TGGCTTCCAAACATCCTC GTAGAGGCATCCAGCACA ACATCATCACGACCAGTA CATCCACCAACAGCAACA CCTTCTCAAATGGCTCCTC ATAGCCTCACTCCCGAAAG
为进一步验证本研究筛选的引物的特异性和准确性，笔者额外收集了来自中国不同地理区域的12个李种质的DNA 样本，进行InDel 分子标记的验证分析。这些样本主要包括西南地区的粉黛脆李、凤凰李、脆红李；北方地区的国峰、大红袍、黄干核；华南地区的岭溪李；华东地区的檇李、奈李；以及杏李中的恐龙蛋、味帝和用于观赏的种质紫叶李。
使用引物P1-21 检测时，蜂糖李与台湾蜜李、黄干核李、岭溪李带型一致，为双条带，而其他李种质表现为单带型。当使用引物P4-46 进行检测时，蜂糖李与三华李的带型相同，与其他李种质的带型均存在差异，尽管粉黛脆李、凤凰李等种质也表现为双条带，但其中一条带的位置在500 bp以下，与蜂糖李和三华李明显不同。经多次PCR 检测，结果稳定一致，因此使用引物P1-21 与P4-46 结合，可以区分出蜂糖李与本研究中所用的其他李种质（图5）。
图5 InDel 标记P1-21、P4-46、P3-38 对供试李种质的检验结果
Fig.5 Test results of InDel markers P1-21，P4-46，and P3-38 in the evaluated plum germplasm
A.P1-21；B.P4-46；C.P3-38。1.黄皮蜂糖李；2.青皮蜂糖李；3.一点红蜂糖李；4.蜜李1 号；5.安顺本地晚熟李；6.晚熟青脆李；7.四月李；8.打帮李；9.冰脆李；10.台湾蜜李；11.三月李；12.三华李；13.粉黛脆李；14.凤凰李；15.脆红李；16.国峰7 号；17.大红袍；18.黄干核李；19.岭溪李；20.檇李；21.黄金奈李；22.恐龙蛋；23.味帝；24.紫叶李。
A.P1-21; B.P4-46; C.P3-38.1.Huangpifengtangli; 2.Qingpifengtangli; 3.Yidianhongfengtangli; 4.Mili No.1; 5.Anshunbendiwanshuli; 6.Wanshuqingcuili; 7.Siyueli; 8.Dabangli; 9.Bingcuili; 10.Taiwanmili; 11.Sanyueli; 12.Sanhuali; 13.Fendaicuili; 14.Fenghuangli; 15.Cuihongli;16.Guofeng No.7;17.Dahongpao;18.Huangganheli;19.Lingxili;20.Zuili;21.Huangjinnaili;22.Konglongdan;23.Weidi;24.Ziyeli.
同时，笔者还利用重测序数据中预测到的InDel位点，对蜂糖李的3个品系，即黄皮、青皮和一点红，进行了分子标记引物的设计。经过一系列的引物筛选，笔者发现标记P3-38 可在3 个蜂糖李品系中经PCR 扩增产生不同的条带，黄皮蜂糖李在100 bp 位置产生一个特异的条带，青皮蜂糖李在100~250 bp之间产生一个特异的条带，而一点红蜂糖李均未发现有上述两个特异条带。因此，利用该引物可有效区分蜂糖李的3个主要品系（图5）。
3 讨 论
3.1 中国李的花粉形态特征及外壁纹饰差异
本研究中12 个供试李种质的花粉均为单粒花粉，按照极性、对称类型以及萌发器官的特征，他们被划分为NPC分类系统中的N3P4C5类型。供试李种质花粉的形状为长球形或超长球形，极面观呈三裂圆形，赤面观则呈长椭圆形，外壁纹饰由条纹与穿孔构成。在前人研究中，李属植物花粉的赤道轴与极轴长度接近，形状为近球形，例如部分杏品种[13]以及喜马拉雅臭樱[14]，但更多的研究表明李花粉通常为长球形或超长球形，如 李[15]、多数欧洲李[16-17]，这些观察结果与本研究一致，同时在NPC 分类上也与本研究的结果相符。
在亲缘关系较近的植物花粉中，花粉外观的差异更多体现于外壁纹饰上，外壁纹饰对种质鉴定与分类的研究具有重要意义[18]。在猕猴桃属植物中，花粉外壁纹饰可分为条纹、规则瘤状、不规则瘤状、小沟状或穿孔等4 种类型，判别花粉外壁纹饰对其分类与分组有着较大价值[19]。同时，在龙胆科[20]、凤仙花[4]等植物中也发现了同科、同属的外壁纹饰上存在差异的现象。在李属植物中，花粉的外壁纹饰被发现有条纹-穿孔、脑纹-穿孔、疣状-穿孔、穿孔但表面较光滑、条纹无穿孔等[15，17]。全球主要的李栽培与商业品种为欧洲李或中国李，他们在国际上均被划分在真李组内[21]。本研究供试种质，包括贵州本地李种质、广东李种质与引进种质，均为二倍体的中国李，在外壁纹饰上的表现均为条纹-穿孔，与前人对福建产李种质 李的发现一致[15]，这可能说明了原产自南方的李种质之间的亲缘关系较为密切，这与魏潇等[22]的观点相符。
因此，笔者认为李属花粉的大小、形状、极面与赤面观上的差距较小，李属植物中不同种间的差异主要集中于外壁纹饰上。在亲缘关系较近的同一组间，外壁纹饰的类型差距也相对较小，主要的差异表现在外壁纹饰的孔频、孔径、脊宽和脊间距上。在本研究的3 个蜂糖李品系中，一点红蜂糖李的外壁纹饰的孔频、孔径与其余品系存在一定的差距，蜂糖李与其他种质间的差异也主要集中于上述特征，孢粉学中的外壁纹饰特征能为鉴别蜂糖李及其品系提供一定的参考信息。
3.2 蜂糖李与四月李的孢粉学差异及进化程度
通过对花粉外观和外壁纹饰数据的聚类分析，笔者发现蜂糖李与三月李、四月李之间存在较大的差距，这暗示他们的亲缘关系较远。在实际生产中，从种苗到果实销售过程中，四月李常与蜂糖李发生混淆，但他们无论从管理到果实品质上都存在较大的差异。孢粉学上的较大差异对蜂糖李与四月李的区分具有一定的参考价值，孢粉学可以作为区分蜂糖李与四月李的辅助方法。
植物花粉大小的进化趋势在不同的研究中存在不同的观点。在一些植物中，如玉兰亚属[23]和枇杷[24]，认为花粉由大到小进化。然而，也有研究认为花粉由小型演化为大型[18，25]。在外层纹饰的进化趋势上，普遍认为植物花粉的复杂性随着进化程度的增加而增加。外壁纹饰通常呈现从简单到复杂、从条纹到穿孔、从颗粒与棒刺状到条纹网状的演化规律[26-27]。在前人对中国李的孢粉学研究中，中国李花粉通常表现出较为规则的条纹结构且穿孔较少，因此认为中国李的进化程度相对较低[28]。在本研究的供试李种质中，多数为大型花粉，条纹较为规则，条脊主要呈波浪形或条形，存在少量的分支与交叉。与其他供试种质相比，四月李的花粉条纹较密，孔径相对较小。四月李在贵州的种植历史相对较久，属于较为原始的种质，其花粉外壁纹饰特征在供试种质中进化程度也相对更低。
3.3 分子标记与孢粉学结合在种质鉴别中的准确性
花粉作为植物的繁殖器官，其结构主要由基因型决定，受环境等外部因素的影响较小[12]。然而，由于在不同的研究中对花粉的处理和保存方法存在差异，以及花粉外壁纹饰特点的判定标准不够一致，存在主观性，因此不能单纯依赖孢粉学来进行种质区分和鉴别[18]。在实际应用中，应结合基因分析和形态学等多方面的数据进行综合判定才更为准确。
在DNA 分子标记的实际应用中，种质鉴别是最广泛的应用之一，主要使用共显性标记，如SSR 标记和InDel标记。桃[29]、山杏[30]等物种的研究已表明了SSR 标记在构建指纹图谱或分子身份证方面的重要性。随着全基因组重测序技术的发展，InDel标记在果树的真假杂种鉴定方面具有优越性[31]。王珏等[32]对中国樱桃进行了InDel标记的开发，并发现在蔷薇科果树中具有较强的通用性。汤雨晴等[8]利用InDel 标记鉴别金兰柚，利用最少两对InDel 分子标记即可区分金兰柚与其他47个柚品种，证明使用引物组鉴别种质具有一定的可靠性。笔者利用重测序数据筛选出的InDel分子标记P1-21与P4-46可以区分蜂糖李与供试的其他21 个李种质。在本研究中贵州本地的李种质如打帮李、安顺本地晚熟李与蜂糖李在孢粉上差距较小，而他们在标记P1-21 与P4-46 的鉴定中表现出不同的带型，能够直观、快捷地对他们进行鉴别区分。
孢粉学结果虽然能够表达更多的遗传信息，可作为判断种质之间亲缘关系的一种重要的参考依据，但作为品种鉴别的方法，具有一定的局限性。在本研究中，一点红蜂糖李的花粉外壁纹饰与其他品系存在差异，同时标记P3-38 能区分蜂糖李中的黄皮、青皮和一点红。这对引物能在任何生长阶段为这3 个品系的鉴别提供参考，弥补了孢粉学上存在的时效性问题。但未来还需进一步对上述引物的准确性进行验证，对蜂糖李中的品系进行进一步的划分，并开发更多的分子标记以及其他鉴别方法，完善蜂糖李的鉴别体系。
4 结 论
笔者在本研究中揭示了蜂糖李与三月李、四月李在孢粉特征上存在显著区别，不同品系蜂糖李孢粉差距集中在外壁纹饰上。笔者还开发了2 对In-Del 分子标记，联合使用能够将蜂糖李与其他21 份李种质有效区分，同时还筛选出一对InDel 分子标记，可用于区分蜂糖李中的3个品系。
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