生物体正常行使功能必须依赖蛋白质等大分子物质，经复杂翻译修饰作用（post-translatioanal modification，PTM）的蛋白质可以发挥正常功能及相互之间的调节作用[1]。蛋白质翻译修饰的类型众多[2]，其中，脂链修饰根据连接脂肪酸链的类型不同，分为豆蔻酰化（myristoylation）、酰基化（acylation）等类型[3-5]。棕榈酰基转移酶（palmitate transferase，PAT）催化的酰基化是将棕榈酰基以硫脂键的方式转移到蛋白质的半胱氨酸残基上，从而影响蛋白质生物合成过程[6-8]。催化这个反应的是一类活性中心含有Asp-His-His-Cys (DHHC)基序的酶，因此它们又被称为DHHC 家族[9]。棕榈酰基转移酶最先被发现于酵母中[10-11]，并广泛存在于哺乳动物与植物中[12-13]。在杨树的相关研究中，利用酰基-生物素交换法和质谱法鉴定出的酰基化蛋白参与物质运输、信号转导和胁迫的响应[14]。其中DHHC 类棕榈酰基转移酶是目前研究最多的家族。前人研究表明，在许多高等植物基因组中均鉴定出了数目不等的PAT 家族成员，例如水稻（Oryza sativa）有30 个，玉米（Zea Mays）有40 个，拟南芥（Arabidopsis thali‐ana）有24 个等[15-16]。人们对拟南芥中PAT 家族成员研究最为透彻，其中AtPAT4[17]、AtPAT10[18]、AtPAT13、AtPAT14[19-20]、AtPAT15[21]、AtPAT21[22]、AtPAT24[23]等在生长发育、衰老、非生物胁迫反应等过程中具有重要作用，并且根据演化关系将拟南芥中24个PATs聚为3 个分支，PAT1~9 属于分支一，PAT11~16 属于分支二，PAT18~22 属于分支三，其余成员由于演化关系较远并未进行聚类分析[24]。
板栗（Castanea mollissima）原产于我国，营养物质丰富，是中国重要的经济作物之一。中国的板栗种植总面积约为186.6万hm²，年产量高达194.7万t，占世界板栗年总产量一半以上，稳居世界首位[25]。板栗种植主要位于浅山地带，灌溉条件有限，往往靠自然降水补充水分。同时，当栽植地区的土壤pH超过7.5、含水量低于田间最大持水量的26.6%时，其生长阶段易受到多种环境胁迫的影响，包括盐胁迫、干旱胁迫等[26]。板栗生产中也会遭受多种病虫害侵袭，其中栗疫病最为严重[27]。因此，提高板栗的抗逆性，对提高板栗产业极为重要。
笔者通过比对PAT 保守结构域序列，在板栗全基因组中鉴定出了21 个PAT 基因家族成员，并分析其系统发育树、基因结构、理化性质、染色体定位、共线性和启动子顺式作用元件等信息，同时分析板栗PAT家族在不同胁迫下的基因表达模式，为板栗PAT基因家族抗逆功能的分析提供理论研究基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
材料为在北京市怀柔区板栗试验站采集的燕山红栗，选取大小、质量一致的燕山红栗种子，放置在温度24 ℃、湿度60%的恒温培养箱中催芽，催芽后利用1/2 Hogland 营养液进行水培，置于人工气候室（室温23~25 ℃，光周期：16 h光照/8 h黑暗）培养，获得具有根系的板栗实生苗，选取生长一致的幼苗进行后续试验。
1.2 板栗PAT 基因家族成员的鉴定及多序列比对和系统进化树构建
从板栗基因组网站（http://castaneadb.net/）下载板栗基因组数据，包括基因数据文件，蛋白数据文件、GFF 注释文件等。利用pfam（http://pfam.xfam.org/）查找PAT家族基因隐马尔科夫模型（PF01529），并下载所需家族hmm 数据信息。使用HMMER3.0搜索得到24 个PAT 蛋白序列，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）Conserved Domain Search和SMART 对初筛得到的候选基因家族成员进行结构域信息查对，对比剔除无DHHC 结构域的蛋白序列，最终确定21 个板栗PAT基因家族成员。将选取的21 个板栗PAT 蛋白序列和24 个拟南芥PAT 蛋白序列使用ClustalW 进行多序列比对，通过软件MEGA11.0[28]中的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建进化树，Bootstrap 检验设定1000 次重复，其他参数设置为默认参数。使用在线网站itol（https://itol.embl.de/）对系统发育进化树进行美化。并根据与拟南芥的进化关系，对板栗进行命名，例如Cm08G00098命名为CmPAT10、Cm05G00499 命名为CmPAT14、Cm01G01675 命名为 CmPAT7、Cm04G01227 命 名 为 CmPAT5、Cm05G00558 命名为CmPAT13、Cm01G02604 命名为 CmPAT8、Cm11G00608 命 名 为 CmPAT3、Cm03G00880 命名为CmPAT19、Cm04G02086 命名为CmPAT17 等，进化关系较远或无进化关系的Cm07G01540 命名为CmPAT40、Cm05G01777 命名为CmPAT77。
1.3 板栗PAT基因结构与Motif可视化分析
利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）进行CmPATs 保守结构域分析，使用TBtools 中的Gene Structure View 对基因结构和保守结构域进行可视化分析。
1.4 板栗PAT 基因家族的蛋白质理化性质分析和亚细胞定位
利用ExPASy（https://www.expasy.org/）对板栗PAT 基因家族成员进行蛋白质理化性质分析，预测PATs 氨基酸数目、蛋白分子质量、等电点、亲水性平均系数、脂肪系数等，通过WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）预测PAT 蛋白的亚细胞定位。
1.5 板栗PAT基因家族染色体定位与共线性分析
使用MCScanX（The Multiple Collinearity Scan toolkit）工具进行染色体定位分析并作可视化处理[29]，并对板栗与拟南芥PAT 基因的复制事件进行共线性分析[30]，使用TBtools作可视化图。
1.6 板栗PAT 基因家族的启动子顺式作用元件分析
在TBtools软件中，提取PAT 基因上游的启动子前1.5 kb序列，顺式作用元件的预测利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）进行[31]，可视化结果使用TBtools绘图显示。
1.7 板栗PAT基因转录因子的预测
CmPATs 基因的转录因子由在线网站http://plantregmap.gao-lab.org/预测得到[32]，其词云由在线网站https://www.genescloud.cn/制作而成。
1.8 不同的胁迫处理
选取生长状况一致的水培实生苗进行土培，对土培材料进行200 mmol·L-1 NaCl的胁迫处理，以不加NaCl 为对照，每个处理3 盆（1 盆1 株），并分别在7、10和14 d时采取同样位置0和200 mmol·L-1 NaCl处理的叶片。
在进行干旱处理时，选取长势一致的水培转土培的板栗实生苗30 株，采摘新鲜叶片，分别在新鲜叶片失水量为0%、5%、30%和50%时取样。
在进行抗病处理时，选取新鲜板栗树枝条，用打孔器打孔，深度以达到形成层未到木质部为准，将培养3 d 的栗疫病菌丝块接种于枝条的打孔处。以只进行打孔处理的新鲜枝条为对照。取样时间分别为接种后的0、12、24 h和3 d。
以上样品均用液氮进行速冻后放置-80 ℃超低温冰箱保存待测，每个处理均为3次重复。
1.9 RNA 提取、cDNA 合成及实时荧光定量PCR分析
使用E.Z.N.A.Plant RNA Ki（tOmega）试剂盒提取RNA。cDNA 的合成使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒(TaKaRa，大连)。选择Cmactin 作为内参基因[20]，利用Primer 3.0 设计21 个CmPAT 基因的qPCR 引物（表1），并由生工生物工程股份有限公司（上海）合成。使用Super Real Pre MixPlus (SYBR Green)试剂盒(Takala，大连)，在CFX96（BIO-RAD，USA）上进行反应，每个样品3 次重复。qPCR 反应程序为：预变性95 ℃2 min，变性95 ℃15 s，退火58 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，共40 个循环。利用2-△△Ct法计算CmPATs 相对表达量。
表1 qPCR 引物序列信息
Table 1 qPCR primer sequence information
基因名称Gene name CmPAT3 CmPAT4 CmPAT5 CmPAT7 CmPAT8 CmPAT10 CmPAT11 CmPAT12 CmPAT13 CmPAT14 CmPAT15 CmPAT16 CmPAT17 CmPAT18 CmPAT19 CmPAT21 CmPAT22 CmPAT23 CmPAT24 CmPAT40 CmPAT77上游引物Upstream primer TGATAGGCGGATTGGTTCTC ACAAGCGAATGATGGGAAAC ATAACCGTGGGTGTGCTCTC TCCAAATATGGGGAAAGCTG CCTTCAATTCCCTCGAACAA GATGGAAGTCAGCTGGGAAG ATGCTGGGGTTGTGGATTAC GAATTTGGAGGCTGGTGGTA CCCCAAACTGGAGACCTGTA TTTTGGGACAGACCAACGA CTCTCCATCCCAGTCTCAGC AGACCCCGATAACCCAATTC ATGGCAGTGCAGTGGG ATGGTGGGAATGGCAATTTA GGGATCATTCTTCTCCGTCA TTTGTCCGATGCTTTGTTGA GGATGGCAACTTCCTTACCA TTCATTATGTGGCGGTTCAA TGGCAATGTTGATCACTGGT CTTCCCCACTTTTCATCCAA CTACAGCTGTTGGCCTCCTC下游引物Downstream primer ATCTGATTCAGGTGGCTTCG TTGCTCCCTAACAAATGATCG CTTTGCCCTGAAGTTGTTCC TGCGCTTCACAATTATCTGC CGAGGCGGTCGATATAACAT GCAGTTGTTCCTTGGGGATA GATTTGTTATGGCCCCACAC GTCCGTCAGAAGACCACGTT TGTGCCTAAACCTGGTCCAT TCCTGGGAATCAAAGTCAGG CCCAGCTGAGCTCTGTAACC CACGGGGAGGCTTATACTGA TCAGCCCAACTTTGATTTGG TTGTGATTTCCGCAATTCTG CCCCCAACTTCACCTACTGA TGCATAAGGCCACCACAATA CCCAACAAAAGGAGCAAAGA CTGGGAAGCCTGTGAGGTAG AGCATGGTTGATCCACTTCC GAAAACAAAAGCCGAAGCTG CCAAATCGGCAGATCTCATT
2 结果与分析
2.1 板栗PAT基因的系统进化树分析
利用HMMER、NCBI-CDD和SMART在板栗全基因组水平上进行搜索，并对获得的CmPAT 基因进行Blast，最终鉴定了21 个CmPAT 基因。为了解CmPAT 蛋白的功能及进化关系，将21 个CmPAT 蛋白序列与拟南芥的24 个AtPAT 蛋白进行蛋白多序列比对，构建系统发育进化树（图1）。根据拟南芥分组情况，将系统进化树分成6 个亚组（Ⅰ~Ⅵ）。在6 个亚组中，Ⅴ组和Ⅵ组为最小分支组，分别仅有一个成员：Cm08G0098 和Cm07G01540，最大分支组为Ⅰ组（AtPAT1~9）和Ⅱ组（AtPAT11~16），均有6 个成员。在多序列比对中，21 个CmPAT 成员均具有DHHC结构域。
图1 板栗PAT 家族成员的系统发育进化树
Fig.1 Phylogenetic tree of Chinese chestnut PAT family members
2.2 CmPATs的基因结构和Motif可视化分析
为了深入研究CmPATs 的结构异同，通过在线网站MEME，在系统发育树的基础上预测到了PAT序列中的10 个保守基序和基因结构图（图2）。在21 个PAT基因中，发现每个PAT基因中包含不同种类和数目的Motifs。其中Motif4 存在于6 个CmPAT 基因中（CmPAT7、CmPAT3、CmPAT4、CmPAT5、CmPAT77、CmPAT8），Motif5 存在7 个CmPAT 基因中（CmPAT7、CmPAT3、CmPAT4、CmPAT5、CmPAT77、CmPAT8、CmPAT17）、Motif7和Motif10 共同存在4 个CmPAT 基因中（CmPAT22、CmPAT21、CmPAT18、CmPAT19），说明它们具有相似的功能，在进化关系上也比较近。各个CmPAT 的基因长度差异较大，范围为3750~24 300 bp。所有的PAT 基因都含有Motif1，则Motif1 应为DHHC 保守结构域。CmPAT77 不存在UTR 区，CmPAT40、CmPAT15只有1 个UTR 区，其他基因都具有2 个以上的UTR区。
图2 板栗PAT 基因结构与motif 可视化
Fig.2 Chinese chestnut PAT gene structure and motif visualization
2.3 板栗PAT 基因家族的蛋白理化性质分析和亚细胞定位
利用pfam 数据库与板栗V4 基因组进行比对分析，获得了板栗基因组中包含一个DHHC 结构域的21 个基因。随后对其蛋白序列进行蛋白质理化性质分析，发现序列长度差异较大，在274~794个氨基酸之间，氨基酸长度最长的是CmPAT77，最短的是CmPAT15。平均分子质量为51.27 kDa，等电点为5.91~9.82，其中只有CmPAT3、CmPAT14、CmPAT23、CmPAT24、CmPAT77 这5 个蛋白的PI 小于7，说明多数板栗PAT 蛋白表现为碱性，少数为酸性。脂肪指数为73.60~104.69。蛋白的平均亲水性（GRAVY）为-0.279~0.419，其中GRAVY为正值的有10个CmPAT 蛋白，负值的有11 个CmPAT 蛋白。通过蛋白疏、亲水性分析发现，仅有CmPAT12、CmPAT13、CmPAT16、CmPAT17、CmPAT40、CmPAT77 这6 个PAT 蛋白脂肪系数大于100，为疏水性蛋白，其余均为亲水性蛋白。同时，有12 个PAT 蛋白的不稳定系数小于40，9 个PAT 蛋白不稳定系数大于40，表明板栗PAT 家族中大多为稳定蛋白。其中CmPAT77除了上述PAT 家族共有的DHHC 保守结构域外，还具有特异的泛素蛋白激酶序列。通过WoLF PSORT Prediction 进行亚细胞定位，发现CmPAT7定位在叶绿体，CmPAT4 定位在细胞核，CmPAT23定位在细胞质，剩余18 个PAT 蛋白定位在质膜中（表2）。
表2 CmPATs 蛋白理化特性分析和亚细胞定位
Table 2 Physicochemical properties analysis and subcellular localization of CmPATs protein
蛋白名称Protein name CmPAT3 CmPAT4 CmPAT5 CmPAT7 CmPAT8 CmPAT10 CmPAT11 CmPAT12 CmPAT13 CmPAT14 CmPAT15 CmPAT16 CmPAT17 CmPAT18 CmPAT19 CmPAT21 CmPAT22 CmPAT23 CmPAT24 CmPAT40 CmPAT77氨基酸数Aminoacidsize 425 450 430 443 426 349 338 311 356 307 274 286 392 507 735 659 628 546 641 329 794分子质量Molecular weight/Da 47 821.67 51 095.13 48 985.74 49 843.42 48 148.08 40 228.00 38 600.26 34 984.96 40 254.22 34 696.35 31 047.34 32 177.58 44 253.72 58 404.28 79 486.22 71 872.75 68 763.81 60 336.61 70 202.33 36 945.34 88 528.14等电点pI 6.63 7.11 8.84 8.99 7.92 8.69 8.87 7.14 8.53 6.70 8.75 8.44 8.91 9.82 8.66 8.02 8.93 6.59 6.36 8.51 5.91亲水性平均数GRAVY-0.205-0.279-0.104-0.118-0.144 0.112 0.270 0.359 0.340 0.221 0.340 0.301 0.334-0.206-0.186-0.090-0.129-0.080-0.199 0.419 0.066不稳定系数Instability index 35.98 37.59 44.86 36.29 41.83 46.10 41.78 34.80 31.97 41.18 41.36 45.27 34.41 39.20 53.02 56.44 34.41 33.23 32.29 38.13 35.85脂肪指数Aliphatic index 78.14 73.60 79.51 79.37 86.92 93.04 91.15 104.69 102.64 97.13 95.29 103.53 100.97 85.33 75.09 84.01 84.20 90.46 87.38 104.26 102.70结构域Domain DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC DHHC ANKYR Ank_2 DHHC PHA03095 Ank_2 DHHC DHHC E1_enzyme亚细胞定位Subcellularlocation质膜Plasma membrane细胞核Nucleus质膜Plasma membrane叶绿体Chloroplast质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane细胞质Cytoplasm质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane质膜Plasma membrane
2.4 板栗PAT基因的染色体定位和共线性分析
绘制CmPAT 基因在染色体上的分布图，并利用1~12 号染色体表示基因在染色体上的分布（图3）。21 个基因家族成员不均匀分布在1 号、3 号、4号、5 号、7 号、8 号、10 号、11 号和12 号染色体上，2号、6 号和9 号染色体上没有CmPAT 基因的分布。CmPAT24、CmPAT7、CmPAT8、CmPAT21 分布于1 号染色体上，CmPAT19 分布在3 号染色体上，CmPAT17、CmPAT11、CmPAT5 和CmPAT22 分布在4号染色体上，CmPAT77、CmPAT15、CmPAT13、CmPAT14、CmPAT12 分布于5 号染色体上，CmPAT40、CmPAT10、CmPAT23 分别分布在7 号、8号和10 号染色体上，CmPAT3、CmPAT4 及CmPAT16 分布在11 号染色体上，CmPAT18 分布在12 号染色体上。对板栗和拟南芥PAT 基因进行共线性分析发现，在板栗与拟南芥之间存在10 个具有共线性关系的PATs，在板栗间无共线性关系的PATs。板栗和拟南芥的PAT 数目相差不大，因此CmPAT 基因家族在物种间分化过程中比较保守（图4）。
图3 CmPATs 的染色体定位
Fig.3 Chromosomal localization of CmPATs
图4 板栗与拟南芥PAT 基因的共线性比对
Fig.4 The collinearity comparison of PAT genes between Chinese chestnut and Arabidopsis thaliana
2.5 CmPATs基因启动子顺式作用元件分析
为探索CmPAT基因的功能，将21个板栗PAT基因上游1.5 kb 的启动子序列提交到PlantCARE 网站进行顺式作用元件预测。如图5 所示，在板栗PAT基因的启动子区域中预测到基本顺式作用元件、光响应元件，激素响应元件，多种逆境胁迫响应元件，植物生长发育相关元件等。基本顺式作用元件数量最多，其中有943 个TATA-box、623 个CAAT-box 和152 个AT~TATA-box 等启动子元件；其次为光响应元件，包括42个Box4、24个G-box、16个TCT-motif、13 个GATA-motif、11 个MRE、9 个GT 1-motif 等；在植物激素响应元件中，含有45 个生长素响应元件（ARE、TGA-element）、19 个赤霉素响应元件（Pbox、TATC-box、GARE-motif、F-box）、24个乙烯响应元件ERE、60 个脱落酸响应元件（ABRE、AAGAAmotif、ABRE4、ABRE3a）、42 个水杨酸响应元件（as-1、TCA、TCA-element）等；在逆境胁迫响应元件中，含有7 个干旱诱导元件（MBS、MBSI）、12 个低温响应元件LTR、20 个损伤诱导元件（WUN-motif、WRE3）、12 个抗病响应元件W-box 等；植物生长发育相关元件包括12 个参与玉米醇溶蛋白代谢调节元件O 2-site、4 个与植物胚乳发育相关元件（GCN 4_motif、AACA_motif）、1 个参与种子特异调控元件RY-element 等；此外还预测到66 个MYB 和61 个MYC 参与环境适应性的响应元件等。推测CmPAT基因在板栗生长发育、激素调控、逆境胁迫及光调控中发挥着重要作用。
图5 CmPATs 基因启动子顺式作用元件可视化
Fig.5 Visualization of cis-acting elements of CmPATs gene promoter
2.6 板栗PAT转录因子对应的词云分析
通过转录因子预测发现，与21 个板栗PAT 基因调控相关的转录因子多达39 种，其中以Dof 蛋白家族的数量最多，BBR-BPC、AP2/ERF、MYB 蛋白家族的数量在300~400 之间，C2H2、GRAS、NAC、WRKY、TCP、HD-ZIP 蛋白家族的数量在100~250之间，bHLH、TALE、bZIP、Trihelix、MYB_related、LBD、CPP、GATA、G2- like、MIKC_MADS、B3、WOX、HSF、C3H、ARF、ZF-HD、SBP 蛋白家族的数量在20~85之间。其中Dof占比22%，AP2/ERF占比17%，BBR-BPC 占比10%。这些转录因子可能在板栗中PAT基因的转录过程中发挥着重要作用（图6）。
图6 CmPATs 转录因子的词云
Fig.6 Word cloud of CmPAT transcription factor
2.7 板栗PAT基因参与不同胁迫响应
为进一步了解板栗PAT 基因在不同胁迫条件下的作用，对板栗实生苗进行不同浓度盐胁迫和干旱胁迫处理，进行板栗PAT基因表达量热图绘制。
如图7-A 所示，21 个CmPAT 基因在不同时期不同程度地参与了盐胁迫响应。在7 d时，相对于对照，有2个基因表达上调，5个基因表达下调。在10 d时，有11 个基因表达上调，其中有6 个基因表达明显上调，2 个基因表达明显下调。在14 d 时，有6 个基因表达上调，5 个基因表达下调，其中4 个基因表达明显下调。以上结果说明CmPAT基因广泛参与盐胁迫的响应。在干旱胁迫处理中，失水量为5%时，有2 个基因表达明显上调，失水量为30%时，有7个基因表达明显上调，失水量为50%时，仅有1 个基因表达未上调，且无表达下调的基因，说明CmPAT 基因亦广泛参与干旱胁迫响应。CmPAT24、CmPAT7、CmPAT14 共同正向参与响应盐胁迫与干旱胁迫（图7-B）。
图7 不同胁迫下CmPATs 基因表达模式
Fig.7 Expression patterns of CmPATs genes under different stresses
A.CmPATs 盐胁迫基因表达量，CK 表示0 mmol ·L-1 NaCl 处理，CT 表示200 mmol ·L-1 NaCl 处理；B.CmPATs 干旱胁迫基因表达量，0%~50%表示不同干旱处理程度；C.CmPATs 抗病胁迫基因表达量，0 h 表示只打孔处理，CK 表示打孔+PAD 琼脂块处理，CT 表示打孔+带有病菌的PAD 琼脂块处理；h 和d 表示处理时间。
A.CmPATs salt stress gene expression, CK is expressed as 0 mmol ·L-1 NaCl treatment, CT is expressed as 200 mmol ·L-1 NaCl treatment; B.CmPATs drought stress gene expression, 0 %-50 % is expressed as different degrees of drought treatment; C.CmPATs disease resistance gene expression, 0 h is expressed as only punching treatment, CK is expressed as punching + PAD agar block treatment, CT is expressed as punching+ PAD agar block treatment with bacteria; h and d are expressed as treatment time.
在植物生长过程中，除了非生物胁迫以外，还面临着病原菌的侵染等生物胁迫，抗病的作用机制也较为复杂。在CmPAT基因响应抗栗疫病的转录组数据中发现，整体基因表达量数值较低。在栗疫病病菌侵染12 h 时，与对照相比，基因表达量明显上调的有2个，为CmPAT11和CmPAT4，分别上调了1.11倍和1.39倍，仅有CmPAT17表达量明显下调，下调了72.61%。在栗疫病病菌侵染24 h时，与对照相比，有6个基因表达量明显上调，分别为CmPAT24、CmPAT7、CmPAT16、CmPAT17、CmPAT14、CmPAT77，其基因表达量上调在1.5倍以上，其中CmPAT14和CmPAT77 的基因表达量分别上调了2.79 倍和2.49倍；CmPAT21 和CmPAT22 基因表达量下调较为明显，分别下调了31%和37%。在栗疫病病菌侵染3 d 时，与对照相比，有6 个基因表达量明显上调，分别为CmPAT7、CmPAT10、CmPAT16、CmPAT23、CmPAT17、CmPAT4，其基因表达量上调在1.5 倍以上，其中CmPAT7 和CmPAT17 表达量分别上调2.61 倍和2.44 倍；CmPAT21、CmPAT5、CmPAT77 基因表达量下调较为显著，分别为42%、44%、57%。CmPAT7、CmPAT16 和CmPAT17 基因表达量在24 h 和3 d 2 个时期里均明显上调，CmPAT21 和CmPAT77 均明显下调，说明他们可能参与了响应栗疫病胁迫的网络（图7-C）。不同的CmPAT 基因在不同胁迫中具有不同程度的响应，其中CmPAT7正向参与了盐胁迫、干旱胁迫和抗病胁迫的调控。
3 讨 论
蛋白质棕榈酰化是一种后转录修饰的可逆反应，棕榈酰基转移酶催化酰基化的发生，发生酰基化的蛋白可以参与多种物质运输、信号转导胁迫响应。因此PAT 家族作为参与调控植物生长发育与逆境胁迫的相关蛋白逐渐进入人们的视野。
在本研究中，笔者共鉴定出板栗中21个PAT基因家族成员，其基因数目与拟南芥基因数目接近，但不同物种间的PAT 基因家族成员数目差异说明该基因家族在植物进化过程中产生一定程度的分化和扩增[33]。将鉴定出的CmPAT 家族成员通过系统发育进化树、基因结构和motif、蛋白质理化性质、染色体定位、基因复制事件、共线性和不同胁迫下表达模式等生物信息学方法进行综合分析。
在系统发育进化树中发现21个CmPAT蛋白中有17个与拟南芥成员存在同源关系，在同一个亚组中的成员含有一致或相似的蛋白保守基序，支持了进化分析的结果，同时也表明在氨基酸水平上存在同源关系的CmPAT 和AtPAT 间可能具有相似的生物学功能。Zhou 等[18]对定位在液泡的AtPAT10 的功能进行研究，表明AtPAT10 对拟南芥的发育及耐盐性至关重要，因此CmPAT10 可能也具有耐盐性等功能。通过分析板栗PAT基因上游启动子中顺式作用元件的组成情况发现，其上游存在大量生长发育和各种胁迫应答相关的顺式作用元件，他们在转录过程中可能受到多种转录因子的调控，以此提高板栗在生长发育过程中的抗逆性。这与其他物种通过对启动子进行分析来研究PAT家族成员对不同非生物胁迫等的响应机制结果一致[34-36]。
板栗在生长过程中，易受到盐害和干旱等非生物胁迫。张新业等[37]对鉴定的27个胡萝卜PAT基因进行盐胁迫处理，发现有3 个DsPAT 响应了盐胁迫。本研究中盐胁迫处理下发现CmPAT24、CmPAT7、CmPAT13、CmPAT14 在10 d 和14 d 表达上调显著。笔者推测这些基因在不同时期可能参与板栗对盐胁迫的响应，与前人研究结果相似。Tian等[33]发现OsPAT30 参与了水稻耐盐性的调控。Qi等[38]研究表明，拟南芥中的一个棕榈酰基转移酶AtPAT10 对盐胁迫响应极为敏感。姜翰[39]在对苹果PAT16的功能进行研究时发现MdPAT16能抵抗盐胁迫并促进苹果糖分的积累。但在拟南芥和苹果中响应盐胁迫的PAT10 和PAT16 在板栗实生苗中并没有明显的响应，这与前人研究结果不一致，同时Tian等[33]的结果也表明了PAT 基因功能在不同物种中对盐胁迫具有一定的保守性。此外，吕慧等[40]发现干辣椒果实在干旱和盐胁迫的共同刺激下，促进了10个基因的表达。在本研究中，CmPAT24、CmPAT7、CmPAT14 亦共同正向响应盐胁迫和干旱胁迫，这与吕慧等[40]的研究结果一致，在盐胁迫和干旱胁迫双重胁迫下促进多个基因的表达。ZmPAT24（Zm‐TIP1）能够调节玉米根毛的长度及参与干旱胁迫的调控[41]。在本研究中，干旱胁迫失水量50%时，大部分CmPAT 基因的表达量均上调，仅有CmPAT21 未表现出明显的抗旱性。这与前人研究结果相似，不同之处在于大部分CmPAT 基因均参与调控板栗响应干旱胁迫。据报道，Deng 等[36]发现部分GhPAT 基因在病原菌、干旱、盐等非生物胁迫下参与响应，并验证了GhPAT27 参与陆地棉花黄萎病抗性响应。Gao 等[42]发现AtPAT13 和AtPAT16 通过棕榈酰化修饰NB-LRR 蛋白R5L1 调控拟南芥的抗病机制。在本研究中，根据抗病胁迫转录组测序的结果发现，CmPAT7、CmPAT16 和CmPAT17 基因表达量在24 h和3 d 2 个时期均明显上调，CmPAT21 和CmPAT77均明显下调。说明他们可能参与了响应栗疫病胁迫的网络。推测这5 个基因极有可能参与板栗抗栗疫病的响应，并在板栗抗栗疫病中特异表达。CmPAT24、CmPAT7、CmPAT14 共同响应盐胁迫和干旱胁迫的调控，CmPAT7 共同响应盐胁迫、干旱胁迫和抗病胁迫的调控，部分CmPAT 基因共同参与各种胁迫，与前人的研究结果一致。
4 结 论
笔者在本研究中共鉴定出21 个板栗PAT 基因家族成员，他们在盐胁迫、干旱胁迫和抗病胁迫等生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。其中CmPAT24、CmPAT7、CmPAT14 共同正向参与了盐胁迫和干旱胁迫的调控，CmPAT7 同时正向响应盐胁迫、干旱胁迫和抗病胁迫。研究结果可为研究板栗PAT基因家族的抗逆功能提供理论基础。
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