荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是一种重要的亚热带和热带常绿果树，野生荔枝的起源中心位于中国云南，随后沿西江传播，在海南形成野生荔枝种群的一个主要栖息地，同时，在东南亚、越南北部和柬埔寨也发现了野生的种质资源[1-2]。近年来，世界各地的极端低温事件频发，在广东地区表现为直接影响第二年荔枝的生长和产量[3-5]。因此，低温是限制荔枝产量的主要因素之一，筛选抗寒性强的荔枝种质、培育耐低温品种是解决这一问题最经济有效的途径，且荔枝种质资源是进行荔枝育种、科研和生产的重要物质基础。
荔枝抗寒种质资源的研究起步较晚，目前仅有少量报道。21 世纪初，佘文琴等[6]就田间荔枝叶片形态与其耐寒性作了分级评价。张永福等[7]对7 份珍贵荔枝种质通过拟合Logistic 方程求半致死温度进行抗寒性评价，证明马贵荔的抗寒性最弱。同时，针对当地气候环境的监测结果，结合荔枝冻（寒）害指标进行对应的避冻区划分，也可以降低低温冻（寒）害对荔枝种植的影响[8]。而针对现有荔枝种质资源进行大量综合性的抗寒性评价研究尚未见报道。在其他物种中，例如66 份葡萄品种、23 个青钱柳和99 种青冈属植物的抗寒性综合评价已有报道[9-11]。虽然荔枝属于亚热带常绿果树，但同样存在着一定程度的抗寒资源，由于相关研究较少，大多数抗寒资源可能尚处于未发现状态，这些资源的搜集、鉴定评价和进一步发掘利用，将为荔枝抗寒品种的培育打下必要的工作基础。
在对西瓜的抗寒性研究中，贾蓝溪等[12]测定了最大光化学效率、相对电导率、丙二醛含量、抗氧化酶活性、根系活力和干鲜质量。同时，在对番茄进行耐低温性评价的试验中，通过测定叶片相对电导率、气体交换参数和叶绿素荧光参数将番茄品种分为3个等级[13]。因此，笔者在本研究中将选取最大光化学效率（Fv/Fm）、相对电导率（relative electrical conductivity，REC）、相对含水量（relative water content，RWC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和脯氨酸（proline，Pro）含量这5 个低温相关的生理生化指标进行测定，并运用相关分析对荔枝种质抗寒系数进行综合评价，将91份荔枝种质进行抗寒性等级划分，为荔枝抗寒种质资源的搜集发掘、鉴定评价及抗寒品种的培育等提供可行的技术方案和参考依据，也为荔枝的育种改良和遗传研究提供材料基础。
1 材料和方法
1.1 试验地及试验材料
试验地位于广东省广州市天河区华南农业大学荔枝种质资源圃，地理坐标为北纬23°09′36″，东经113°20′54″，属于南亚热带季风气候，且有显著的海洋性气候特征。12 月到翌年2 月属于广州的冬季，盛行东北风或北风，月平均气温为12.5 ℃，大部分气候较温暖。但个别年份在寒潮来临时，也可出现霜冻天气，造成低温寒害，温度为0 ℃左右。
本试验所用91 份荔枝种质由华南农业大学园艺学院荔枝种质资源圃提供，分别于2020—2021年和2021—2022 年连续2 a（年）冬季对种质资源圃内的荔枝种质进行调查，包括开花时间以及花期长短，对荔枝种质进行全面的信息统计。同时，将前人研究[14-15]结果和后期调查结果进行汇总（表1）。
表1 91 份荔枝种质基本情况汇总
Table 1 The basic information of the 91 litchi accessions
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表1 （续） Table 1 (Continued)
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表1 （续） Table 1 (Continued)
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表1 （续） Table 1 (Continued)
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表1 （续） Table 1 (Continued)
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1.2 试验设计
在冬季对低温天气进行观察，确定自然低温的开始和结束时间。于低温前对生长势一致且叶片健康的荔枝种质资源进行编号，且选择东、南、西、北4个方向的枝梢进行挂牌标记。其中，低温处理均通过对冬季低温的检测，对预计出现0 ℃左右的低温天气进行重点关注，在经历低温后进行后续试验（实际低温前采样温度为15 ℃，经历的最低温度为0 ℃，经历低温后采样时的温度为4 ℃，此时观察到荔枝叶片出现卷曲的现象，即为荔枝已经经历低温伤害）。在低温前对已标记种质资源进行末次梢第3 或者第4 叶位的叶片取样，取枝条复叶上的小叶，共10 枚。将新鲜的荔枝叶片（去除叶柄）用乙醇擦拭干净，将叶片混合后得到新鲜样品，立即进行相关指标的测定，低温后进行同样操作的叶片采集和指标测定，各指标均3次重复。
1.3 主要仪器及试剂
主要仪器：植物荧光成像仪（IMAGING-PAM，WALZ公司，德国），紫外可见分光光度计（UV-2600/2007岛津，岛津仪器，中国），Fluoroskan Ascen FL荧光化学发光分析仪（Thermo 公司，美国），上海雷磁DDS-307电导率仪（仪电科学仪器股份有限公司，中国），电热鼓风干燥箱DHG-9075A（上海一恒科技有限公司，中国），高速冷冻离心机5804(R)/5801(R)（Eppendorf公司，德国），华志PTX-FA110S电子天平（华志电子科技有限公司，美国），HWS28水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司，中国），SHB-循环水式多用真空泵（郑州科华仪器设备有限公司，中国）。
主要试剂：三氯乙酸（500 g，成都市科龙化工试剂厂），硫代巴比妥酸（25 g，国药集团化学试剂有限公司），石英砂（500 g，广州化学试剂厂），茚三酮（5 g，上海科丰实业有限公司），冰乙酸（500 mL，天津市富宇精细化化工有限公司），氢氧化钠（500 g，天津市福晨化学试剂厂），磺基水杨酸（100 g，广州化学试剂厂），甲苯（500 mL，洛阳市化学试剂厂），95%的乙醇（500 mL，天津市富宇精细化化工有限公司），磷酸（500 mL，广州化学试剂厂）。上述试剂均为分析纯。
1.4 试验方法
PSⅡ最大光化学量子产量（Fv/Fm）测定：选取枝条上叶位处成熟的叶片，立即用湿棉花包裹叶柄处令其继续吸收水分，并用湿纱布包裹，再将待测叶片置于黑暗箱中避光，暗适应处理20 min以上，用Fluoroskan Ascen FL 荧光化学发光分析仪（Thermo，美国）测定Fv/Fm。具体操作步骤按照仪器说明书进行，之后点击窗口下面的Fo、Fm按钮，1 s之后，获得对应材料的叶绿素荧光成像图（初始荧光Fo、最大荧光Fm和PSⅡ最大光化学量子产量Fv/Fm）和Fv/Fm值。
相对含水量（relative water content，RWC）采取烘干法[16]测定。相对电导率（relative electrical conductivity，REC）采用电导法[17]测定。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法[17]测定。脯氨酸（proline，Pro）含量采用磺基水杨酸提取法[18]测定。
1.5 数据处理与分析
利用Microsoft Excel 进行数据处理和计算，利用SPSS 20.0 软件进行相关性检验、正态检验、主成分分析、灰色关联度分析及相关图表生成。以低温前后的两轮数据（每轮数据3个重复）平均值作为基础数据，参照汪灿等[19-20]和欧巧明等[21]的方法进行数据统计分析。
先对低温前后数据进行整理，获得单个指标的相对抗寒系数（cold tolerance coefficient，CC），见公式（1）。
为避免不同测试指标数量级之间差异的影响，依据隶属函数[公式（2）]对原始数据进行归一化处理。
其中，μ（CCi）表示各指标的隶属函数值，CCi表示第i个指标的相对抗寒系数值，max（CC）和min（CC）表示所有荔枝种质第i个指标测定的最大值和最小值。
对各单项指标指数进行主成分分析，以每个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重。采用正交旋转的方法对数据进行旋转。依据简单相关系数矩阵进行因子分析，将原来多个彼此相关的指标转换成新的少数几个彼此独立的综合指标，从而建立综合指标Zj的方程，见公式（3）。bij为第i个指标的单项指标值，j代表第j个综合指标；xi为第i 个指标值。其中，i=1，2，……，n；j=1，2，……，m，m ≤n。
基于隶属函数的耐冷性综合评价值（cold tolerance comprehensive evaluation value，D）进行评价，见公式（4）（5）。
其中，pi为第i 个综合指标贡献率（各指标的特征值即为贡献率），ωi为因子权重系数，表示第i个指标在所有指标中的重要程度。
基于灰色关联度进行计算，见公式（6）。其中，γi是基于各指标CC值作为比较序列，D值作为参考序列，获得各指标CC 值与D 值间的关联度。灰色关联度参考前人的研究方法进行计算[22-23]，ωi（γ）为各指标权重系数。
1.6 抗寒性评价与分级
依据荔枝种质的耐冷性综合D 值，采用欧式距离和加权配对算术平均法（weighted pair group method average，WPGMA）进行聚类分析，划分荔枝抗寒性等级。D值越大，荔枝种质抗寒性越强，D值越小，则荔枝种质抗寒性越弱。根据D 值正态分布特点，确定抗寒程度的分级标准，并参照荔枝矮化[24]和玉米种质资源抗寒性的分级方法[25]，将91份荔枝种质分为高度冷敏感（Ⅰ）、冷敏感（Ⅱ）、中度耐冷性（Ⅲ）、耐冷性（Ⅳ）和高度耐冷性（Ⅴ）5个级别。
2 结果与分析
2.1 荔枝种质在低温前后相关指标的测定结果分析
对Fv/Fm、RWC、REC、MDA和Pro含量5个指标进行测定，分别将低温前和低温后的测定值进行对比分析（图1），经历低温后荔枝种质的各个指标都有明显变化，其中Pro 含量的变化最大，说明这5 个低温相关指标对荔枝种质进行抗寒性程度鉴定评价是切实可行的。
图1 低温前和低温后各个指标在 91 份荔枝种质中的测定分析
Fig. 1 Measurements analysis of various parameters of 91 litchi accessions before low-temperature and after low-temperature
F /F 为 PSⅡ 最大光化学量子产量，RWC 为相对含水量（%），REC 为相对电导率（%），MDA 为丙二醛含量（μmol·mg ），Pro 为脯氨酸含量（μg·g ）。下同。 v m -1 F /F is the maximum photochemical quantum yield of PSⅡ，RWC is the relative water content (%)，REC is the relative conductivity (%)，MDA is malondialdehyde content (μmol·mg )，Pro is proline content v m-1 (μg·g ). The same below.
将以上各指标的测定值进行相关分析（表2），包括变异系数（coefficient of variation，CV）和关联系数（coefficient of association）。结果表明低温之后Fv/Fm 的平均值为0.12，CV 为19.01，经历低温后REC 的平均值为14.77，CV 为40.85。Fv/Fm和REC可在一定程度上反映荔枝种质的受伤害程度，从测试数据可知，低温后雪怀子的Fv/Fm最低，且REC 值最大，说明其受低温的伤害比较大。荔枝种质的RWC值在低温前维持在55%左右，低温后平均降低了13%，而MDA 含量（b，后同）在低温前平均值为35.02 μmol·mg-1，低温后平均值升高到46.39 μmol·mg-1，Pro含量（w，后同）在低温后平均值为404.40 μg·g-1，较低温前升高近10倍。
表2 荔枝种质低温相关指标的测定结果分析
Table 2 Measurement analysis of low-temperature-related indicators in litchi accessions
注：**表示差异极显著（p＜0.01）。
Note:**means extremely significant difference(p＜0.01).
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此外，低温前与低温后各指标的相关系数均达到极显著水平。Fv/Fm和RWC值在低温前测定的平均值较低温后测定的平均值大，而其他性状均表现为在低温后测定的平均值大于低温前测定的平均值。荔枝种质之间的CV 介于3.61%~40.85%之间，表明测定的指标对荔枝种质资源在低温胁迫下反应较敏感，具有较好的低温处理效果。此外，荔枝种质的各项指标在低温前和低温后表型值的相关系数介于0.35~0.95之间，进一步说明各指标对低温胁迫反应的敏感性存在差异。直接采用各项指标的表型值来度量其抗寒性，并不能够全面地体现供试91份荔枝种质的抗寒性差异。同时，也说明只用单个指标进行荔枝种质抗寒性的评价是不可行的，应该结合多个相关指标来对其进行综合评价，这样的评价结果更可靠。
对低温前后荔枝种质的各个指标测定结果进行正态分布检测（表3）。发现低温后荔枝种质的Fv/Fm和RWC 值，以及低温前的Pro 含量均不符合正态分布，其他不同时间的各个低温相关指标均符合正态分布（低温前的REC 值和MDA 含量，低温后的MDA 含量和Pro 含量）或近似符合正态分布（低温前的Fv/Fm和RWC 值，低温后的REC 值）。其中不管是在低温胁迫前还是低温胁迫后，荔枝种质MDA 含量的测定值都表现为极显著，可能是因为该指标在荔枝种质在低温胁迫前后的变化差异比较大。
表3 荔枝低温相关指标的正态性检验
Table 3 Normal distribution test of low temperature-related indicators in litchi
注：a 表示显著水平修正；*表示真实显著水平的下限。
Note:a indicates lilliefors significance correction;*indicates lower bound of true significance.
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进一步分析5个指标测定值的频数分布范围直方（图2）。可以发现Fv/Fm值在低温前分布在0.75~0.8之间的荔枝种质有58份，大于0.8的荔枝种质有7份，小于0.75的荔枝种质有26份，在低温后分布在0.7~0.8 的荔枝种质有43 份，大于0.8 的荔枝种质有1 份，小于0.7 的荔枝种质有47 份，其中4 份荔枝种质低于0.4。REC 值在低温前分布在8%~11%之间的荔枝种质有86 份，小于8%的荔枝种质有4 份，大于11%的荔枝种质只有1份，低温后分布在10~20之间的荔枝种质有60份，小于10的荔枝种质有19份，大于20的荔枝种质有12份。RWC值在低温前分布在40%~50%之间的荔枝种质有48 份，大于50%的荔枝种质有25 份，小于40%的荔枝种质有18 份，在低温后分布在40%~50%的荔枝种质有62 份，大于50%的荔枝种质有7 份，小于40%的荔枝种质有22份。MDA含量在低温前分布在30~40 μmol·mg-1之间的荔枝种质有86 份，小于30 μmol·mg-1的荔枝种质有12份，大于40 μmol·mg-1的荔枝种质有9份，低温后各荔枝种质的MDA 含量均有所升高，而且分布在40~50 μmol·mg-1之间的荔枝种质有52 份，有10份荔枝种质小于40 μmol·mg-1，有29份荔枝种质大于50 μmol·mg-1。Pro 含量在低温前分布在40~60 μg·g-1之间的荔枝种质有89 份，小于40 μg·g-1的荔枝种质有1 份，大于60 μg·g-1的荔枝种质有1 份，而且低温后分布在400~450 μg·g-1之间的荔枝种质有58 份，小于400 μg·g-1的荔枝种质有32 份，大于450 μg·g-1的荔枝种质有1份。根据以上分析结果，初步推断大部分荔枝种质的抗寒性相对较差，只有少部分可能有较强的抗寒性。
图2 低温前（A）和低温后（B）各个指标在91 份荔枝种质中的频数分布直方图
Fig.2 Frequency histogram of each trait in 91 litchi accessions before low temperature(A)and after low temperature(B)
2.2 荔枝种质在低温前后各单项指标的结果分析
对荔枝种质各指标耐冷性系数进行差异分析（表4）。低温处理后，荔枝种质各项指标均产生明显变化。其中，最大值的差异较大，Pro含量的最大值为10.23，Fv/Fm的最大值为1.02，最小值的差异较最大值小，Pro含量的最小值为0.35，Fv/Fm的最小值为5.95。同时，各指标抗寒系数（CC值）的变异系数介于3.89%~34.28%之间，REC 的CV 值最大，为34.28，而RWC 的CV 值最小，为3.89，其中，Fv/Fm的CV 值位居第二，为17.79，之后是MDA 和Pro 含量，分别为6.04 和9.86。这说明不同荔枝种质间的CC值所反映的耐冷性不同，且同一荔枝种质各指标的CC值间也具有较大的差异，即低温胁迫下各项生理指标的变化是不同的。在对荔枝种质的抗寒性进行综合评价时，如果只使用某一个单一的指标进行抗寒性评价，其结果会随着该指标对低温反应敏感性的不同而有明显变化，且不同指标在低温过程中有着不同重要性，想要获得更为准确的抗寒性鉴定分级，仍然需要对多个指标进行测定，并结合隶属函数进行综合分析。
表4 荔枝种质各指标抗寒系数的差异分析
Table 4 Variation analysis of cold resistance coefficient on different characters in litchi accessions
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此外，分析荔枝种质各指标抗寒系数在不同区间的分布情况，结果（表5）显示同一区间各指标CC值的分布次数和频率差异较大。由于CC值是低温后与低温前的各指标比值，因此，CC值越接近于1，表明抗寒性越强。由表5 可知，CC 值大于0.8 的Fv/Fm、RWC、MDA含量、Pro含量和REC的分布频率分别为58.24%、56.04%、14.29%、25.27%和3.3%，表明各指标对低温胁迫反应的敏感程度依次为Fv/Fm、RWC、Pro 含量、MDA 含量和REC。REC 的CC 值在小于0.2区间内的分布频率达到56.04%，表明REC值对低温胁迫的敏感度较高，而RWC的CC值在小于0.2区间内的分布频率仅为2.2%，表明RWC值对低温胁迫的敏感度相对较高。因此，只采用某个单一指标进行荔枝种质抗寒性评价会忽略各指标间复杂的相互关系，也验证了抗寒性相关指标选择的合理性，为获得较为准确的荔枝种质抗寒性鉴定与分级评价结果提供可靠依据。
表5 荔枝种质各指标抗寒系数在不同区间的分布
Table 5 Distributions in cold tolerance coefficients on different characters in litchi accessions
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2.3 荔枝种质在低温前后各单项指标的相关性分析
由于低温相关指标在反映荔枝种质抗寒性方面具有较好的一致性，因此对5 个指标进行相关性分析。结果（表6）表明不同性状之间均存在一定程度的相关性，且大多数性状的相关性达到了极显著水平。Fv/Fm 与RWC、Pro 含量间呈极显著的正相关（p＜0.01），与REC 呈显著负相关（p＜0.01），RWC与Pro 含量呈极显著正相关（p＜0.01），与REC 呈显著负相关（p＜0.01），而REC 与Pro 含量呈极显著负相关（p＜0.01）。即低温相关指标Fv/Fm、RWC、REC与Pro 含量的相关性较显著，能够共同反映荔枝种质的抗寒性强弱。
表6 荔枝低温性状的相关矩阵分析
Table 6 Correlation matrix analysis of low temperaturerelated characters of litchi
Note：**.p＜0.01，*.p＜0.05。
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2.4 荔枝种质在低温前后各指标的因子分析及因子载荷
因子分析是主成分分析的推广，是一种可以把多个变量化为少数几个综合变量的多变量分析方法，其主要目的是用有限的、更基本的但又无法直接测量到的隐性变量来解释原始变量之间的相关关系。通过研究多个变量之间的内部依赖关系，探求已测定数据中的基本结构。同时，用少数几个假想变量来表示其基本的数据结构。假想变量，即为存在的潜在变量，一般称为因子。
笔者在本研究中采用因子分析对5个观测指标的CC值进行分析，通过获得所有指标的特征值、因子载荷和方差贡献率，来更加全面地评价与荔枝种质抗寒性相关的各个指标之间的内在联系。对荔枝种质在低温前和低温后的各指标进行因子分析，结果见表7。通过观察初始特征值、提取载荷平方和，以及旋转载荷平方和的计算结果可知，在提取原则为特征值大于1 的基础上，综合考虑方差贡献率和特征值，一共可以提取4 个主成分作为因子，即F1、F2、F3、F4。这4 个因子的累积方差解释率为87.11%，说明提取出来的4 个因子可以提取出总共87.11%的信息量。这4个因子的方差解释率分别为23.62%，21.90%，20.99%和20.61%，说明这4 个因子的信息提取量分布较为均匀。因此，本研究的因子分析结果较为理想，可用来进行之后的91份荔枝种质抗寒性分析。
表7 所有指标的特征值与累积方差贡献率
Table 7 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate on different characters
注：提取方法为主成分分析法。
Note:The extraction method was principal component analysis.
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将原单项性状指标转换为4个相互独立的公因子（F1、F2、F3、F4），用凯撒正态化最大方差法对以上数据进行正交旋转得到表8。由表8可知，旋转后的第一主成分主要包括Pro含量，且系数为正，说明该变量对第一主成分的影响是正向的。第二主成分主要包括RWC，且系数为正，说明该变量对第二主成分的影响也是正的。第三主成分主要包括Fv/Fm和REC，且Fv/Fm的系数为正，REC的系数为负，这说明这两个变量对第三主成分的影响是Fv/Fm为正，REC 为负。第四主成分主要包括MDA，且系数为正，说明该变量对第四主成分的影响为正。
表8 旋转后的成分矩阵
Table 8 The rotated feature matrix
注：旋转方法为凯撒正态化最大方差法。
Note：The rotation method is Caesar normalizing maximum variance method.
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综上所述，通过分析各个指标对主成分的影响，发现Pro含量、RWC、Fv/Fm和MDA含量均是正向的影响，而REC 则是负向的影响，说明不同测定指标对主成分的影响有所不同，而通过转化成主成分F1、F2、F3和F4可以更好地对荔枝种质抗寒性进行综合评价，进一步获得较为准确的抗寒性分级。
2.5 荔枝抗寒性的综合评价
根据之前的结果得到4 个主因子，以此建立不同荔枝种质抗寒性强弱的评价模型，依据表9 各因子得分系数计算4 个主因子的得分，其因子得分的计算公式为：
表9 因子载荷矩阵以及各性状指标与D 值的关联度和位次
Table 9 Factor load matrix and the correlation degree and rank of each trait index and D values
注：D值为参考序列。
Note:D values are the reference sequence.
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F 值反映了树体耐冷程度，F 值越大，对应树体的耐冷特性越明显，反之，F 值越小，对应树体的冷敏感特性越明显。在获得各公因子特征向量的基础上，利用模糊隶属函数法，据公式（2）计算各因子隶属函数值（µ），依据公式（4）各因子权重系数（ω），对各因子隶属函数值（µ）赋予相应权重系数（ω），按公式（5）计算加权隶属函数值，作为综合抗寒性的量值（D 值），以便较为准确地评价荔枝种质的抗寒性。
参考于萍等[22]的研究方法，将所有观测指标的抗寒系数（CC值）作为比较序列，D值作为参考数列进行灰色关联度分析，获得观测指标的CC值与D值间的关联度，结果（表9）显示各指标与D 值的密切程度依次为Pro 含量、RWC、Fv/Fm、REC 和MDA 含量。因此，与荔枝种质耐冷性关系最为密切的是低温相关指标Pro含量和RWC，其次是Fv/Fm和MDA，关联度最弱的是REC。
2.6 荔枝抗寒性的综合评价
将上述计算获得的91份荔枝种质的D值汇总，得出表10，其中荔枝种质编号对应的种质名称已在表1 中详细列出，此处仅用编号进行汇总。综合D值越高，表明该荔枝种质的抗寒性越强，综合D值越低，则表明该荔枝种质的抗寒性越弱。分析表10，发现测定的91 份荔枝种质资源中D 值最大为0.775，即Lc17 大锦钟，其次是0.739 的Lc62 陈紫和0.745 的Lc74 宋家香，表明在所测荔枝种质资源中以上3 个荔枝种质的抗寒性较强。而D 值最小为0.330，即Lc13 金线果，其次是0.372 的Lc71 下番枝和0.375 的Lc36 兰竹，表明在所测荔枝种质资源中以上3个荔枝种质的抗寒性较弱。
表10 荔枝种质编号及抗寒性度量值（D 值）
Table 10 The D values of cold tolerance in litchi accessions
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为了更加清晰地对91份荔枝种质资源进行抗寒性评价分级，以荔枝种质的耐冷性综合D值为基础，对荔枝种质的D值进行系统聚类分析，得到图3、图4。在λ=5处，将91份荔枝种质的抗寒性等级划分为5 个等级，即高度冷敏感（Ⅰ）、冷敏感（Ⅱ）、中度耐冷性（Ⅲ）、耐冷性（Ⅳ）和高度耐冷性（Ⅴ）。其中，大部分荔枝种质都被划分到耐冷性（Ⅳ）这一分类中，高度冷敏感（Ⅰ）和高度耐冷性（Ⅴ）这两类都相对较少，说明荔枝种质的抗寒能力大部分较为集中。
图3 荔枝种质聚类分析
Fig.3 Clustering analysis of litchi germplasm resources
图4 不同耐冷性材料类群各观测指标的抗寒系数及综合D 值比较
Fig.4 Comprehensive comparison of cold tolerance coefficients and D values
箱体.箱体显示了数据的四分位数，其中箱体的底边表示下四分位数（Q1），箱体的顶边表示上四分位数（Q3）箱体内部的线表示中位数。25 分位：第一四分位数（Q1），又称“较小四分位数”等于该样本中所有数值由小到大排列后第25%的数字。75 分位：第三四分位数（Q3），又称“较大四分位数”等于该样本中所有数值由小到大排列后第75%的数字。四分位差（IQR）：四分位差，它是上四分位数（Q3，即位于75%）与下四分位数（Q1，即位于25%）的差。四分位差反映了中间50%数据的离散程度，数值越小说明中间的数据越集中，数值越大说明中间的数据越分散，上下边界.须的末端：表示数据中的最大值和最小值。若数据中存在超出须长度的数据点，通常将其视为异常值（远离箱体的离群数据点）。
Box.The box shows the quartiles of the data，where the bottom edge of the box indicates the lower quartile(Q1)，and the top edge of the box indicates the upper quartile(Q3)，and the line inside the box indicates the median.The 25th percentile：the first quartile(Q1)，known as the“lesser quartile”,is equal to the 25th percentile of all values in the sample in descending order.The 75th percentile：the third quartile(Q3)，known as the“larger quartile”is equal to the 75th percentile of all values in the sample in descending order. Interquartile Richness (IQR)：the interquartile difference，which is the difference between the upper quartile(Q3，the 75th percentile)and the lower quartile(Q1，the 25th percentile).The Quartile Deviation reflects the degree of dispersion of the middle 50%of the data，with smaller values indicating that the data in the middle is more concentrated and larger values indicating that the data in the middle is more dispersed.Upper and lower boundaries：the ends of the whiskers，indicating the maximum and minimum values in the data.If there are data points in the data that exceed the length of the whisker，they are usually considered outliers(outlying data points that are far from the box).
将荔枝抗寒性分级评价结果进行分类汇总（表11）。结果表明，Ⅰ类为高度冷敏感荔枝种质，有金线果、下番枝、兰竹、大造、尚书怀、犀角子和乌叶舅，共7份，占总数的7.69%；Ⅱ类为冷敏感荔枝种质，有观音绿、水东、雪怀子、三月红、Salathiel、Kwai May Pink、黑妃红、岭丰糯、年年红1 号和十月荔，共10份，占总数的10.99%；Ⅲ类为中度耐冷性荔枝种质，共23份，占总数的25.27%；Ⅳ类为耐冷性荔枝种质，共40 份，占总数的43.96%；Ⅴ类为高度耐冷性荔枝种质，有娘喜紫、桂林、金钟、及第、东刘一号、状元红、大红袍、乌叶、宋家香、陈紫和大锦钟，共11 份，占总数的12.09%。综上所述，以上结果基于低温相关指标的测定，通过因子分析对荔枝抗寒性程度进行综合评价和分级，建立了比较客观准确的抗寒性鉴定方法，探索出评价荔枝种质抗寒性的量化评价标准，为荔枝抗寒种质资源的发掘和筛选提供了有效的参考依据。
表11 基于D 值对91 份荔枝种质抗寒性分级评价情况
Table 11 Evaluation of cold-tolerance of 91 litchi accessions based on D value
?
依据系统聚类划分的5个类群，分别对5个不同耐冷性材料类群的各性状抗寒系数和综合D值进行分析。由图4 可知，低温对Pro 含量、RWC、Fv/Fm、MDA含量和REC有显著影响，表现为随着抗寒性的增强，在低温胁迫后Pro 含量、RWC 和Fv/Fm呈显著升高的趋势，REC 和MDA 含量呈显著降低的趋势。同时，5 个耐冷性类群由Ⅰ~Ⅴ综合D 值依次呈现升高的趋势。
3 讨 论
3.1 荔枝种质抗寒性资源的发掘与利用
中国荔枝种质资源十分丰富，主要分布于南亚热带地区，由于其在长期发育中对温度有较高的要求，使其不能在全国进行推广栽培，故选育抗寒性强的荔枝种质显得尤为重要[26]。随着全球极端低温气候事件频发，华南地区冬季也常常伴随着连续出现的霜冻天气，在冬季气温降至4 ℃，会造成大面积的荔枝冻害[27]，在低温降到0 ℃以下时，会使荔枝叶片和枝条受害，甚至使树干受损，整株死亡[28]。随着中国大力发展农业，对农业结构进行不断调整，鼓励特色农业发展，荔枝种植面积逐年增加，目前全国种植面积稳定在58 万hm2，面积和产量均占全世界总量的70%以上[29]。由此可见，对荔枝抗寒性种质资源的发掘与利用对培育耐寒性荔枝品种或砧木具有十分重要的意义。
3.2 果树抗寒资源的鉴定与评价
近年来，果树抗寒性预选指标在大量研究中被报道[30-31]，Fv/Fm反映PSⅡ反应中心内原初光能的转化效率[32]，进一步反映叶片光合作用受低温影响的情况，直接影响其抗寒能力[33-34]；RWC值可以很好地反映植物抗逆性，通常其值越高，对应的渗透调节功能和抗性就越强[35]，用REC 值大小直接反映果树在低温下细胞膜受伤害程度[36-38]；MDA 是膜脂过氧化的终产物[39]，其含量高低代表质膜受损伤的程度，与果树抗寒能力密切相关[40]；Pro是一种维持膜稳定的物质，其积累量越多，果树抗寒性越强[41]。另外在形态、生理、生化等方面也都进行了详细报道[42-44]，相关研究表明这些指标与植物抗寒性都存在直接或者间接的联系。实际上，果树抗寒是一个复杂的过程，在低温下其表型性状受多种因素影响，且不同物种对低温响应的机制差异很大，使用单一指标无法准确地评价其对低温的耐受能力，因此进行果树种质低温抗寒性评价需要将各个指标进行综合考虑[45]。同时针对不同物种选择适宜的指标，结合隶属函数法、主成分分析和聚类分析法，可以更好地对不同物种耐寒性进行评价，为选育抗寒性强的种质资源提供基础[46-47]。
低温下叶绿素荧光特性的变化在梨[48]、小麦[49]、咖啡[50]中均被证明。在对不同基因型的白鸡冠F1代抗寒性研究中，林郑和等[51]通过测定叶绿素荧光动力学可区分不同后代的抗寒水平。Fv/Fm值降低的程度与不同品种的抗冷性之间呈现较显著的相关性，在老芒麦[52]的抗寒性鉴定中已有报道。除此之外，低温其他相关指标差异也均有报道[53-55]，对葡萄抗寒性进行全面评价时，孙艳等[56]测定6 个葡萄品种根系RWC以进行抗寒性鉴定，而在荔枝种质上的研究未见报道。另外，在低温下对5 个梨品种分别测定多个生理生化指标，其中包括REC、MDA和Pro含量，结合隶属函数分析法得出新梨七号是其中抗寒性最强的[35]。在对树上干杏不同株系抗寒性的鉴定评价中，于庆帆等[57]也选择了REC、MDA和Pro含量这些指标，建立了较为可靠的树上干杏抗寒性评价方法。在石榴[58]、苹果[59]和猕猴桃[60]的抗寒性评价研究中，也将REC 和MDA 含量作为抗寒性评价指标。蔡汝鹏等[61]对三月红（♀）和紫娘喜（♂）的杂交后代进行10 个枝叶性状指标鉴定，分析各性状变幅、分布频率、变异系数等。由此可见，通过Fv/Fm、RWC、REC、MDA 和Pro 含量5 个指标的测定，对鉴定评价荔枝抗寒性具有一定的可行性。
3.3 荔枝种质抗寒性综合评价
在对荔枝种质抗寒性研究中，通过对5 个指标进行相关性分析，发现Fv/Fm、RWC、REC 和Pro 含量存在极显著的相关性，能够共同反映荔枝的抗寒性程度。再经过主成分和灰度关联分析，结果显示5 个指标与D 值的密切程度均高于0.7，进一步明确低温相关指标，为荔枝种质抗寒性评价提供依据。同时，相关分析方法在葡萄[62]、石榴[63]和桃[64]的综合评价中多有报道。通过正态检测和系统聚类分析，笔者在本研究中参考低温下205份玉米种质抗寒性评价分级类型[25]，结合D 值大小，将91 份荔枝种质资源划分为高度冷敏感（Ⅰ）、冷敏感（Ⅱ）、中度耐冷性（Ⅲ）、耐冷性（Ⅳ）和高度耐冷性（Ⅴ）5个等级，并确定了每个等级的典型代表品种。依据该分级方法，明确了大锦钟、陈紫和紫娘喜为高度耐冷性品种，这与前人研究一致[6，65]。说明该评价方法具有较高的可靠性，为荔枝抗寒种质资源的搜集发掘、鉴定评价及抗寒品种的培育等提供了可行的技术方案和参考依据。
4 结 论
本试验中选取5个指标的相对测定值进行抗寒性的综合评价，结果显示低温对Fv/Fm、RWC、REC、MDA 和Pro 含量有显著影响，这5 个指标是评价荔枝种质抗寒性较理想的生理指标。测定91 份荔枝种质在自然低温胁迫下生理生化指标的变化情况，并结合一系列相关分析进行综合评价，将荔枝种质资源抗寒性分为5个等级，即高度冷敏感（Ⅰ）、冷敏感（Ⅱ）、中度耐冷性（Ⅲ）、耐冷性（Ⅳ）和高度耐冷性（Ⅴ）。同时，筛选出大锦钟、陈紫等为相对抗寒性高的荔枝种质，以及冷敏感种质金线果，为荔枝的育种改良和遗传研究提供材料基础。
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