在自然环境状态下，植物遭受着各种非生物胁迫的威胁。非生物胁迫包括干旱、高温、高盐和低温，是影响植物的正常生长和发育的主要因子[1]。植物通过转录因子（transcription factor，TF）结合启动子特异的元件，调节功能基因的表达以响应外界信号[2]。AP2/ERF 是一大类植物特异性转录因子，其特征在于存在稳定的AP2 结构域。根据AP2 结构域的数量，AP2/ERF 被分为4 个亚家族AP2、DREB、ERF 和RVA[3]。其中，DREB（dehydration responsive element-binding protein）是植物特有的一类转录因子，在逆境应答中发挥重要作用[4]。
近年来，研究人员通过对光皮桦[5]、玉米[6]和沙冬青AP2/ERF[7]转录因子家族鉴定与分析发现，DREB 类转录因子参与响应干旱、高温或低温胁迫的应答，这表明DREB 可能是植物抗逆相关的关键调节因子。相关研究发现，DREB 蛋白能特异性地识别共同的核心序列A/GCCGAC 的DRE/C 重复（CRT），以调控下游基因的表达进而增强非生物胁迫耐受性[8]。如苔藓类BaDBL1 通过诱导应激响应基因的表达，进而增强了转基因植物对干旱和高盐胁迫的耐受性[9]。胡萝卜DcDREB1A基因通过提高转基因植物的活性氧清除能力，使得胁迫反应基因的表达上调，正向调节了转基因植物的抗旱性[3]。海棠MhDREB2A 基因通过调控胁迫相关基因的表达，使得转基因植物对干旱胁迫的耐受性增强[10]。百合LIDREB1G基因过表达不仅提高了转基因植物的萌发率和存活率，还促进了胁迫相关基因的表达，使得转基因植物对干旱、高温和低温的耐受性增强[11]。由此推测，不同的植物物种可能是DREB 功能存在差异的原因。
火龙果（Hylocereus monacanthus）[12]是贵州、广西等喀斯特地区的特色和优势产业，在农业结构调整和扶贫开发等方面发挥了重要作用。同时，火龙果还具有较高的经济效益和很强的抗逆性。关于火龙果抗旱的机制，前人从功能基因[13]、miRNA[14]和转录因子[15]等方面开展了研究工作。根据笔者团队前期的研究，DREB 转录因子参与了火龙果抗旱响应[16]。在此基础上，笔者在本研究中克隆火龙果DREB1D 基 因 开 放 阅 读 框（open reading frame，ORF）全长序列，通过异源遗传转化分析其在非生物胁迫应答中的表达特性，并解析其生物学功能，旨在为深刻认识火龙果抗旱机制提供信息，也为抗逆遗传育种提供新资源。
1 材料和方法
1.1 RNA提取及cDNA的合成
以30 d 苗龄的紫红龙组培苗（苗高6～8 cm）为试验材料，利用Plant RNA Kit（Omega，上海）提取试剂盒，参照说明书方法提取肉质茎RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量，然后用反转录试剂盒（TaKaRa，日本）合成cDNA第一链。
1.2 HmDREB1D克隆和序列分析
在火龙果基因组数据库（http://www.pitayagenomic.com）中查找DREB 片段同源序列[17]，并命名为HmDREB1D，利用引物设计网址（https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html）中的方法，设计无缝克隆引物（表1）。以cDNA 为模板进行PCR扩增，使用胶回收试剂盒（TaKaRa，日本）对目的片段回收纯化。选用即用型无缝克隆试剂盒（生工，上海）对将目的片段与pCambia35s-EGFP 载体进行连接，连接条件为50 ℃、20 min，将重组质粒转化于大肠杆菌感受态细胞DH5α（全式金，北京），采用PCR技术鉴定阳性菌落并送上海生物工程有限公司（Sangon）测序，将构建的过表达载体命名为pCambia35s-HmDREB1D。
表1 火龙果HmDREB1D 基因克隆及功能分析所用引物序列
Table 1 Primer sequences used for cloning and functional analysis of pitaya HmDREB1D
注：小写字母代表载体片段序列。
Note:The lowercase letters represent the vector fragment sequence.
用途Usage基因克隆Gene clone亚细胞定位For subcellular localization转基因验证Transgenic verification qRT-PCR引物名称Primer name HmDRE Y-HmDRE pCambia35s HmDRE q-HmDRE内参基因Reference gene Atactin RD20应激基因表达Expression of stress genes序列Sequence F:acgaacgatagccatggtaATGGATACACTGACGTGGAATACTAAT R:gcgctcagttggaattctagaCTAAATAGAGTAGCTCCACAGTGGGA F:cgatagccatggtaccATGGATACACTGACGTG R:gccgcgccggatccAATAGAGTAGCTCCAC F:ctcgagaattcaacacaacatat R:gcgctcagttggaattctagaCTAAATAGAGTAGCTCCACAGTGGGA F:AAGGGCAGGTCGGAAGAAGTT R:TGGTATCAGAGGAAGCAGGGA F:GCACCCTGTTCTTCTTACCGA R:AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG F:TACACTTCCGAGTTGGGTGC R:AACCGTTAGCGCGTATTTGC F:TGGAGAAGGACTTGGTTCGC R:GAACCAGCTTCCACCGAGAA F:CTTGGGTTTGGAAACTGCCG R:GTTGTCCTTTGTTCGTGCCC F:CGAGCAAGCCAAAGCAATGT R:TCCATCTCTGTTCCCTCGGT F:ATGGCGATGTCTTTATCAGGAGC R:TGACGGTACCAACACCACTCTG F:CAACAGCTCTTCTTCCTCTTCG R:CCTTTCTTATCTTCCTCTCCTTCA RD22 HSP70 HSFA1D COR15A COR47
对HmDREB1D 蛋白与其他植物中的DREB 蛋白序列进行多序列比对和进化分析，多序列比对使用https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi进行，利用MEGA11 进行系统进化树构建，设置Bootstrap为1000次，其他参数默认。
1.3 HmDREB1D基因亚细胞定位分析
以pCambia35s-EGFP 载体为基础，采用无缝克隆技术克隆HmDREB1D 蛋白序列，方法见1.2。设计引物去除终止密码子（表1），构建植物过表达载体pCambia35s-HmDREB1D-GFP。将验证正确的pCambia35s-HmDREB1D-GFP 重组质粒和pCambia35s-GFP 空载质粒，采用冻融法分别转入农杆菌感受态GV3101中。参照文献[18]中的方法，将重悬菌液注射于1月龄的本氏烟草下表皮（背面）。避光培养72 h 后，撕取下表皮制片，在激发波长488 nm和发射波长510 nm 条件下，用激光共聚焦显微镜TCS-SP8（Leica 德国）观察并拍照。
1.4 HmDREB1D基因过表达拟南芥的产生
采用浸花法[19]浸染野生型拟南芥，收取种子后。在含50 g·L-1潮霉素的1/2 MS培养基中进行转基因植株的筛选，利用DNA 试剂盒（天根，北京）对阳性植株进行DNA提取，使用特异性引物（表1）对转基因进行PCR验证。
利用Plant RNA Kit 提取试剂盒（Omega，上海），提取转基因和野生型拟南芥的RNA，并合成cDNA 第一条链。使用Primer Premier 5.0 软件设计HmDREB1D 特异性荧光定量引物（表1），参照Biomarker Fast2×SYBR Green qPCR 试剂盒（Thermo Fisher Scientific，北京）进行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），表达水平由梯度荧光定量PCR 系统检测（Bio-Rad，美国）。设置3 个生物学重复和3 次技术重复，以Actin 基因为拟南芥内参基因（表1）。根据最终的Ct 值，使用2-ΔΔCt 的 分 析 方 法 计 算HmDREB1D 基 因 的 表 达 水平[20]，并挑选高表达的3个株系用于后续功能研究。
1.5 转基因拟南芥非生物胁迫的耐受性评价
选用T3代超表达株系和野生型种子进行表面灭菌，对于萌发干旱胁迫试验，将种子播种于含250 mmol·L-1甘露醇的1/2 MS 培养基中，在植物生长室中培养，培养条件为16 h（24 ℃），黑暗8 h（20 ℃）。每处理播种30粒，3个生物学重复，7 d后统计萌发率，萌发率（%）=种子萌发数/供试种子总数×100。对于生长特性试验，将种子播种于普通1/2 MS 培养基中培养7 d，然后转移至含250 mmol·L-1甘露醇的1/2 MS 培养基中，每处理20 株幼苗，3 个生物学重复，7 d后测定其根长度和鲜质量。
为了进一步分析HmDREB1D 转基因植株对各逆境胁迫的耐受性，选择5 周龄的T3代超表达和野生型株系，进行不同的逆境胁迫处理。对于干旱胁迫处理，将20%PEG6000 溶液从植物根部浇灌3 d，每天50 mL，然后再浇水5 d。对于高温胁迫处理，将植物放置42 ℃下处理1 d，正常条件下（24 ℃）恢复5 d。对于低温胁迫处理，植物在-20 ℃下处理1 h，正常条件下（24 ℃）恢复5 d，统计存活率。同时，分别在干旱胁迫（3 d）、高温胁迫（1 d）和低温胁迫（1 h），采集处理前后植物的叶片用于物理指标测定和应激基因表达分析的模板。
参考电导仪法[21]测定相对电导率，采用电导仪Jenco 3020（JENCO，美国）进行试验操作，每个试验3 次重复。计算公式为：相对电导率（%）=C1/C2×100（C1：煮沸前的电导率；C2：煮沸后的电导率）。而过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，选择POD、SOD和CAT检测试剂盒（索莱宝，北京），按说明书进行测定。
1.6 应激相关基因表达分析
选取已经被证实的与应激相关的基因，包括干旱应激反应基因RD20、RD22[22]，热休克基因HSP70、HSFA1D[23- 24] 和 低 温 应 激 基 因COR47、COR15A[25]，引物序列见表1。收集胁迫处理前后的叶片，提取RNA 并合成cDNA，以拟南芥Actin 为内参基因，采用qRT-PCR 技术检测HmDREB1D 基因逆境胁迫处理下的表达水平，检测及表达量分析参照1.4进行。
1.7 数据统计学分析
所有数据分析使用Excel 2010软件统计并绘制柱形图，数据显示为3个独立试验的平均值±SE（n=3；生物学重复）。使用单项方差分析*p＜0.05 和**p＜0.01进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 HmDREB1D基因克隆与序列分析
克隆得到DREB1D 基因，并命名为Hm-DREB1D。通过对其他植物中的DREB 蛋白序列进行多序列比对，发现HmDREB1D 基因属于AP2超家族，且具有典型的AP2 保守结构域（图1-A）。系统进化分析表明，DREB 家族转录因子可分为2个亚家族（DREB1s 和DREB2s）。HmDREB1D 蛋白属于DREB1s 亚组，且HmDRE1D 蛋白序列与拟南芥AtDRE1D 蛋白序列具有高度相似性（图1-B）。
图1 火龙果HmDREB1D 蛋白与其他植物DREB 序列比对及系统发育分析
Fig.1 Comparison and phylogenetic analysis of pitaya HmDREB1D protein gene with other plant DREB sequences
A.来自火龙果HmDREB1D 和其他植物物种的DREB 的蛋白多重序列比对。红色代表完全一致的氨基酸，序列上方是标注的结构域区域，下方是保守氨基酸的LOGO。B.火龙果中HmDREB1D 蛋白和其他植物物种中典型DREB 蛋白的系统发育树分析。包括拟南芥At-DRE1A、AtDRE1B、AtDRE1C、AtDRE1D、AtDRE1E、AtDRE1F、AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、AtCBF4、AtDRE2A、AtDRE2B1、AtDRE2C、At-DRE2D、AtDRE2E、AtDRE2F（16 个DRE）；来自水稻的OsDRE1A、OsDRE1B、OsDRE1C、OsDRE1D、OsDRE1E、OsDRE1F、OsDRE1G、Os-DRE1H、OsDRE1I、OsDRE1J、OsDRE2A（11 个DRE）。
A. Protein multiplex sequence alignment of DREB from dragon fruit HmDREB1D and other plant species. Red represents completely identical amino acids,the top of the sequence is the marked domain region,and the LOGO of the conserved amino acids is as follows.B.Alignment and phylogenetic relationship of multiple sequences of HmDREB1D and DRE from pitaya.Phylogenetic tree analysis of HmDREB1D protein in pitaya and typical DREB proteins in other plant species. Including Arabidopsis AtDRE1A, AtDRE1B, AtDRE1C, AtDRE1D, AtDRE1E, AtDRE1F, AtCBF1,AtCBF2, AtCBF3, AtCBF4, AtDRE2A, AtDRE2B1, AtDRE2C, AtDRE2D, AtDRE2E, AtDRE2F (16 DRE), and Oryza sativa OsDRE1A, Os-DRE1B,OsDRE1C,OsDRE1D,OsDRE1E,OsDRE1F,OsDRE1G,OsDRE1H,OsDRE1I,OsDRE1J,OsDRE2A(11 DRE).
2.2 HmDREB1D基因过表达载体构建
选取测序正确的菌株进行过夜摇菌，提取质粒进行PCR 验证，得到预期723 bp 的基因片段，表明成功构建过表达载体pCambia35s-HmDREB1D-GFP（图2-A）和pCambia35s-HmDREB1D（图2-B）。
图2 pCambia35s-HmDREB1D-GFP 和pCambia35s-HmDREB1D 载体构建
Fig.2 Construction of pCambia35s-HmDREB1D-GFP and pCambia35s-HmDREB1D expression vector
2.3 HmDREB1D基因亚细胞定位
为了验证HmDREB1D 蛋白在体内的亚细胞位置，将构建的pCambia35s-HmDREB1D-GFP 载体，通过瞬时转化注射于烟草叶片中，激光共聚焦显微镜跟踪观察HmDREB1D 蛋白的亚细胞定位。结果显示（图3），pCambia35s-HmDREB1D-GFP 的GFP荧光主要定位于细胞核，而GFP蛋白均分布于整个细胞表面，说明HmDREB1D 蛋白定位在细胞核中，作为转录因子发挥作用。
图3 HmDREB1D 蛋白的亚细胞定位
Fig.3 Subcellular localization of HmDREB1D protein
2.4 HmDREB1D拟南芥遗传转化与生长特性
为了分析HmDREB1D 基因的功能，将Hm-DREB1D 基因在拟南芥中过表达，共获得6 株超表达HmDREB1D 转基因拟南芥植物。筛选3 株高表达转基因纯合系（OE3、OE4、OE5）（图4-A）进一步分析。
图4 HmDREB1D 基因表达分析及生长特性
Fig.4 Gene expression analysis and growth characteristics of HmDREB1D
A.分析所有过表达HmDREB1D 转基因株系的相对表达水平；B.HmDREB1D 转基因拟南芥与野生型拟南芥在干旱胁迫下种子的萌发状态；C. 萌发率分析；D.HmDREB1D 转基因拟南芥与野生型拟南芥在干旱胁迫下幼苗根和植株的生长状态；E、F. 根长度和鲜质量分析。所有试验包括3 个生物学重复，所有数据以（平均值±SE）显示数据，*表示与野生型的显著差异（*p＜0.05 和**p＜0.01）。下同。
A. Analysis of relative expression showing overexpression of all HmDREB1D transgenic plant. B. Seed germination of HmDREB1D transgenic plant and wild type A. thaliana under drought stress. C. Analysis of germination rate (%). D. The growth and development of seedling roots and plants of HmDREB1D transgenic plant and wild type A.thaliana under drought stress.E,F.Analysis of root length(cm)and fresh mass(mg).All experiments were repeated three times.Data are shown as the(mean±SE)of three independent experiments.*significant difference with wild type(*p＜0.05 and**p＜0.01).The same below.
对T3代超表达株系幼苗期干旱胁迫耐受性进行统计分析。野生型拟南芥的萌发率仅为37.3%，而转基因株系的萌发率保持在87.8%以上（图4-B～C）。转基因株系的根长度、鲜质量均显著高于野生型（图4-D～F）。结果表明，过表达HmDREB1D基因显著提高了对干旱胁迫的耐受性。
2.5 逆境胁迫下超表达株系的表型分析
选择5 周龄的野生型和转基因拟南芥进行干旱和高、低温胁迫处理（图5）。结果表明，在干旱胁迫3 d 后，野生型植株发生明显皱缩且叶片泛黄，而过表达HmDREB1D 转基因株系叶片没有发生明显的皱缩，且叶片仍是大片绿色；正常浇水5 d后野生型存活率仅为21.8%，而转基因的存活率OE3 为44.3%，OE4 为82.6%，OE5 为64.6%（图5-A）。在高温胁迫24 h 后，野生型叶片明显干燥，而大多数过表达转基因植株仍然保持新鲜叶片，正常温度（24 ℃）下恢复5 d 后野生型存活率为20%，而转基因的存活率OE3 为43.3%、OE4 为82.6%、OE5 为61.3%（图5-B）。在低温胁迫下1 h后，野生型大部分被冻伤，叶片大多数变黄或萎蔫，而转基因拟南芥仍保持叶片鲜绿，正常温度（24 ℃）下恢复5 d 后，野生型存活率为21.7%，而转基因的存活率OE3 为52.3%，OE4 为84.0%，OE5为66.7%（图5-C）。过表达HmDREB1D基因显著提高了转基因拟南芥在干旱、高温和低温胁迫下的存活率。
图5 过表达HmDREB1D 的转基因拟南芥在干旱、高温、低温胁迫下的表型
Fig.5 Phenotypes of transgenic A.thaliana overexpressing HmDREB1D under drought,high and low temperature stresses
所有试验包括3 个生物学重复，每个试验使用36 株植物。以（平均值±SE）显示数据。
All experiments were repeated three times with 36 plants.Data are shown as the(mean±SE)of three independent experiments.
2.6 逆境下超表达株系的生理生化反应
除了存活率外，还包括生理特征，如相对电导率和抗氧化活性酶（POD、SOD、CAT）活性的测定。在正常条件下，野生型与转基因株系之间的生理参数无显著差异，而在干旱和高、低温胁迫条件下，转基因拟南芥中相对电导率显著低于野生型（图6-A），且POD、SOD、CAT 的活性显著高于野生型（图6-B～D）。这些数据表明，过表达HmDREB1D基因通过提高抗氧化活性，降低细胞膜损伤程度，进而增强了转基因拟南芥抗干旱、高温和低温胁迫的能力。
图6 在干旱、高温、低温胁迫处理下转基因和野生型拟南芥的生理指标分析
Fig.6 Analysis of physiological indicators in transgenic and wild type A.thaliana under drought,high and low temperature stress treatments
2.7 逆境下超表达株系应激相关基因的表达分析
为了了解HmDREB1D 基因如何增强对逆境胁迫响应的能力，采用qRT-PCR技术检测转基因株系和野生型中相关应激基因表达水平（图7）。结果显示，在正常条件下转基因植物中应激响应基因的表达水平出现上调，但是在干旱、高温和低温胁迫处理下，与野生型相比，转基因植物体内干旱（RD20、RD22）、高温（HSFA1D、HSP70）和低温（COR47、COR15A）应激基因的表达水平显著上调。这表明，HmDREB1D 基因通过上调应激相关基因的表达来增强转基因植物对不同非生物胁迫的应激能力，从而提高转基因植物抗干旱、高温和低温的能力。
图7 在干旱和高、低温胁迫和对照条件下不同转基因株系和野生型拟南芥中应激响应基因的表达分析
Fig.7 Expression analysis of Stress-responsive genes in different transgenic lines and wild type A.thaliana under drought and high and low temperature stresses and control conditions
3 讨 论
本研究从火龙果肉质茎中克隆得到Hm-DREB1D基因，多序列比对和进化分析表明，该基因具有典型的AP2 结构域，属于A1（DREB1）亚组。有研究表明，A1 亚组主要参与干旱诱导，而不参与低温诱导[26-27]。但也有研究发现，A1 亚组不仅能参与低温诱导，还参与高温诱导[28-29]。逆境胁迫下，植物的生长状态和存活率在一定程度上可以体现出植物对胁迫环境的响应情况。Ren 等[30]研究发现，过表达AmDREB3 转基因植物在干旱、高盐和高温胁迫下的生长状态和存活率明显优于野生型。本研究中发现，与野生型相比，转基因拟南芥在干旱、高温和低温胁迫下表现出更好的生长状态和更高的存活率。逆境胁迫下，植物体内的相对电导率与植物抗逆性呈负相关[21]，本研究中测得逆境胁迫下转基因拟南芥的相对电导率显著低于野生型。正常环境下，植物体内的活性氧清除系统使细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）保持在较低的水平,以保证植物正常生长[31]。当植物受到逆境胁迫时，抗氧化酶活性的增强能有效地帮助植物避免细胞膜氧化损伤[3]，本研究中测得过表达HmDREB1D 转基因拟南芥在逆境胁迫下体内抗氧化酶POD、SOD和CAT的活性均显著高于野生型。以上研究结果表明，过表达HmDREB1D 转基因拟南芥通过降低逆境胁迫所产生的伤害，提高了植物在逆境胁迫下的存活率，有效地缓解了逆境胁迫对膜系统造成的损伤，进而提高了植物对逆境胁迫的抗逆能力。
除了测定生理指标，本研究还通过qRT-PCR技术对转基因植物进行逆境胁迫响应基因表达水平分析，在逆境胁迫下转基因植物与野生型相比表现出更高的表达水平。相关研究发现，DREB 转录因子通过与许多逆境胁迫相关基因的DRE/CRT 相互作用，使得相关基因的表达上调，从而提高它们在逆境胁迫下的表达能力[32]。苔藓ScDREB8 基因通过上调干旱、高盐和热休克相关响应基因的表达，增强了植物对逆境胁迫的耐受性[33]。因此，过表达Hm-DREB1D基因可能通过提高应激响应基因的表达水平，产生各种能抵御植物氧化胁迫的物质，进而增强了植物对各种逆境胁迫的耐受性。综上所述，DREB转录因子对火龙果逆境胁迫的响应具有关键调控作用，但其分子调控机制还需要进一步的研究。
4 结 论
从火龙果中克隆得到的HmDREB1D 基因属于核定位基因。通过异源转化拟南芥，验证了Hm-DREB1D 基因激活了一系列逆境响应基因的表达，增强了火龙果对干旱、高温和低温胁迫的耐受性。本研究为火龙果抗性研究的分子机制和新种质的创制奠定了基础。
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