砂糖橘（Citrus reticulata Blanco‘Shatangju’）是我国南方地区的主栽柑橘品种，仅广东、广西种植面积就达到16.67 万hm2，年产量约250 万t，是华南地区山区农民增收的重要树种，在乡村产业振兴方面具有重要的经济社会价值[1]。砂糖橘主要种植于南方山地、丘陵等干旱缺水地带，干旱胁迫是影响砂糖橘生长发育、果实品质、高产稳产的重要因素，如何降低干旱对柑橘的胁迫作用是生产中亟待解决的问题[2]。柑橘抗旱品种选育及推广是防止干旱胁迫最经济有效的措施，因此揭示柑橘干旱胁迫生理机制并克隆相关抗性基因，对砂糖橘抗旱品种选育具有重要意义[3]。
多胺（polyamines，PAs）是一类具有生物活性的低分子脂肪族含氮碱，参与柑橘植物胚胎发生、根系形态建成、芽形成及植株生长、成花及开花调控、果实形成及发育、气孔闭合及气体交换、光合作用及叶绿素荧光现象等诸多生长发育和生理过程[4]。植物PAs 主要以二胺的腐胺（putrescine，Put）、三胺的亚精胺（spermidine，Spd）以及四胺的精胺（spermine，Spm）形式存在。在PAs 合成过程中，首先通过3 种精氨酸代谢途径来合成Put，第一种途径植物会通过精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase，ADC）催化的精氨酸脱羧产生胍基丁胺，然后在胍基丁胺脱氨酶和N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶连续催化下形成Put；第二种途径是精氨酸能在ADC 催化下直接合成Put，或者胍基丁胺在胍基丁胺脲水解酶作用下合成Put；第三种途径主要存在于动物和真菌中，精氨酸被线粒体中的精氨酸酶催化为鸟氨酸，然后在鸟氨酸脱羧酶作用下转变成Put。Spd、Spm 合成则需要借助甲硫氨酸代谢途径，L-甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶以及脱羧酶的催化下生成脱羧S-腺苷甲硫氨酸（decarboxylated S-adenosylmethionime，dc-SAM），然后在亚精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）催化作用下，Put 接受dcSAM 提供的一个氨丙基生成Spd；最后在精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）催化下，Spd接受一个氨丙基后转变为四胺的Spm[4]。前人研究表明多胺与植物抗旱性状密切相关，Yang等[5]发现水稻能通过增强叶片的PAs生物合成来维持细胞渗透压，从而适应干旱胁迫。Shi 等[6]研究报道了PAs 能通过调控叶片的气孔闭合，抑制叶片水分和电解质流失，从而缓解干旱胁迫。Yao 等[7-8]研究发现外喷PAs 能增加黎檬（C.li-monia）的根长、根系表面积、根体积和根尖数，促进根系吸水，缓解干旱胁迫。在植物PAs合成过程中，Spd、Spm 是以Put 为底物进一步合成，而ADC 是植物通过精氨酸代谢途径合成Put 的第一关键限速酶，因此克隆植物ADC 基因对研究PAs 合成调控及干旱胁迫生理机制具有重要意义。
目前在葡萄[9]、枳[10]、甜橙[11]、桃树[12]、杜梨[13]等果树中已分离并克隆了ADC基因，上述果树ADC基因不含内含子结构，其开放阅读框（ORF）介于2178～2262 bp之间，编码720～753个氨基酸。但关于砂糖橘CrADC 的基因克隆以及表达与功能分析等研究尚未见报道。笔者在本研究中以砂糖橘为材料，成功克隆得到CrADC基因并进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR 检测不同组织中和干旱胁迫处理下该基因的表达量，并通过稳定遗传转化烟草对该基因进行功能验证，以期为CrADC 基因参与PAs 生理调控的分子机制提供基础，并为砂糖橘抗旱分子育种提供候选基因。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试材料为广东地区种植的砂糖橘品种，由肇庆市四会果园提供。选择6 年生砂糖橘植株并参照唐文武等[14]的方法获取春梢期嫩叶、越冬期老叶、花芽期花苞、30 d 幼果果肉以及30 d 幼果果皮，置于-80 ℃冰箱保存后提取总RNA，用于不同组织的基因表达分析。选用6 年生砂糖橘的新发秋梢，于10%PEG-6000溶液中模拟干旱胁迫处理，处理时间分别为0、3、6、9、12、24 和36 h，3 次重复，每个处理所采叶片置于液氮速冻后提取总RNA，用于干旱胁迫下的CrADC基因表达特征分析。
1.2 主要试剂
柱式植物RNAout 2.0 试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，M-MLV 反转录试剂盒购自美国Life technology 公司，TaKaRa LA Taq®酶、各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、凝胶回收试剂盒Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 以及载体构建的In-Fusion®HD Cloning Kit 等试剂盒均购自TaKaRa 公司（日本），SYBRTM Green Ⅰ核酸荧光染料购自ThermoFisher 公司，大肠杆菌DH5α 感受态细胞、农杆菌GV3101 感受态细胞、克隆载体pMD19-T 和植物表达载体pBI121 均由笔者课题实验室保存提供。主要设备仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ThermoFisher 公司）、T100 PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）、GelDoc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。
1.3 砂糖橘CrADC基因克隆
1.3.1 叶片总RNA 提取及cDNA 第一链的合成取6 年生砂糖橘果树的嫩叶，按照柱式植物RNAout试剂盒说明提取叶片总RNA，按照M-MLV 反转录试剂盒操作步骤合成cDNA第一链。
1.3.2 引物序列设计及PCR扩增 根据柑橘泛基因组育种数据库（http://citrus.hzau.edu.cn）公布的甜橙（C.sinesisi）v3.0版ADC基因序列（Gene ID：Cs_ont_8g020080），设计并筛选到1 对PCR 引物（CrADC-F/CrADC-R），其引物序列见表1。以反转录合成的cDNA 为模板扩增砂糖橘CrADC 基因的cDNA 序列，PCR 反应体系50.0 μL，包括0.5 μL LA Taq，5.0 μL 10×PCR buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），CrADCF 和CrADC-R（10 μmol·L-1）各1.0 μL，2.0 μL cDNA（100 ng），加ddH2O 补充至50 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性4 min；设置30 个循环，94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃60 s；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA 凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段。
表1 所用引物序列及用途
Table 1 The primers sequence and application
引物名称Primer name CrADC-F CrADC-R QCrADC-F QCr ADC-R ACTB-F ACTB-R TranADC-F TranADC-R TranPCR-F TranPCR-R Q-actin-F Q-actin-R引物序列（5’→3’）Primer sequence（5’→3’）CTCACTCTCCTCTCATTTCCCTC GGCCCTACACGGGATCTAAAT CCGTAGCGCCTCCTGCCTACGCCA GTAGGGCGCACCCCAGGAGTCGAT CCAATTCTCTCTTGAACCTGTCCTT TGACTGATGAGAACTGCCAGAAG CGGGATCCATGCCGGCCCTTGGGTGTTGCG CGGAGCTCAGCATAGCAGTATGACCACTGC TTGAAGATGCCTCTGCCGACAGT GCCGGACGATAAGAGGGAGCTGC CTGGCATTGCAGATCGTATGA GCGCCACCACCTTGATCTT引物用途Application基因克隆Gene cloning qRT-PCR柑橘内参引物Reference primer of Citrus表达载体构建Construction of expression vector转基因检测Transgenic test烟草内参引物Reference primer of tobacco
1.3.3 CrADC基因测序 以pMD19-T为克隆载体，将目的基因CrADC与克隆载体连接后，转化到感受态细胞DH5α 中，经涂板、培养、质粒DNA 提取及PCR鉴定后，送上海生工公司进行测序。
1.4 序列分析及系统进化分析
利用Prot Param进行目标基因编码的蛋白质基本理化性质预测，利用Prot Scale 进行亲疏水性分析，利用SOPMA、Predict Protein 预测其二级结构，利用SMART对其功能结构域进行分析，利用DNAMAN 和MEGA7 软件进行蛋白序列多重比较和系统进化树分析。
1.5 CrADC基因表达分析
利用qPCR检测CrADC基因在不同组织及干旱胁迫下的转录表达量，嫩叶、老叶、花、果皮、果肉等样品总RNA 提取及cDNA 合成参照试剂盒的方法。根据CrADC基因序列，设计并筛选了1对特异性引物（QCrADC-F/QCrADC-R，表1），以柑橘ACTB 基因作为内参基因[15]。扩增反应采用SYBR Green Ⅰ染料法在ABI 7500 实时定量PCR 仪上进行，设置3 次生物学重复，数据分析采用2-△△CT法计算[16]。
1.6 植物表达载体构建与烟草遗传转化
设计含有BamHⅠ和SacⅠ酶切位点的引物TranADC-F/TranADC-R（表1），然 后PCR 扩 增CrADC基因。利用BamHⅠ和Sac Ⅰ双酶切pBI121空 载 体，采 用In-Fusion® HD Cloning Kit 法，将CrADC 基因连接到pBI121 载体，转化后经PCR 及测序鉴定，获得重组pBI121-CrADC 植物表达载体。制备根癌农杆菌GV3101感受态细胞并经冻融法转化重组载体，然后采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草[17]，经浸染、共培养、抗性芽筛选、生根培养及分子鉴定获得转CrADC 基因烟草植株。以烟草βactin 为内参基因[18]，利用实时荧光qPCR 检测CrADC基因在转基因植株中的表达情况。
1.7 转基因烟草抗旱性鉴定
选取转基因烟草后代中CrADC 基因表达量高的T3纯合株系，以及对照普通烟草种子。上述种子播种出苗后，移至植物培养箱在24 ℃、70%湿度、16 h光照下正常浇水种植30 d 后，停止浇水20 d 进行干旱胁迫处理。取转基因和对照烟草的叶片，参照李合生[19]方法测定干旱胁迫后的叶片电导率、丙二醛（MDA）含量，以及过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性。参照Wu 等[20]方法取正常生长30 d的烟草叶片称质量，然后置于25 ℃恒温培养箱中自然脱水，分别于15、30、60、90、120 min 后称质量，测定自然脱水后的叶片失水率。上述试验均3 次重复，利用SPSS 软件进行LSD检验。
2 结果与分析
2.1 CrADC基因克隆及序列测定
以砂糖橘嫩叶总RNA 反转录得到的cDNA 为模板，利用CrADC-F/QCrADC-R引物扩增后得到一条约3.0 kb 特异条带（图1）。该扩增条带经回收纯化后进行基因测序，结果显示，砂糖橘CrADC 基因cDNA序列全长为3076 bp，含有1个2262 bp的开放阅读框（ORF），编码753个氨基酸（图2）。
图1 砂糖橘CrADC 基因的PCR 扩增结果
Fig.1 PCR amplification of CrADC from Shatangju
M.DL2000 DNA Marker;1.CrADC.
图2 砂糖橘CrADC 基因序列及其氨基酸序列
Fig.2 Sequence of cDNA and Protein of CrADC of Shatangju
2.2 CrADC蛋白序列比对
利用Prot Param 分析的结果表明，CrADC 蛋白相对分子质量为80.84 ku，理论等电点为5.13，不稳定系数为40.98。Prot Scale 的疏水性分析表明，该蛋白第203位氨基酸疏水性最高，为2.567，第743位疏水性最低，为-2.689，平均亲水性系数为-0.009，属于不稳定亲水性蛋白。SOPMA 二级结构预测显示（图3-A），该蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，分别占41.30%和37.45%，β-转角仅6.61%，扩展束占14.61%。TMHMM 跨膜区分析表明该蛋白不含跨膜结构域（图3-B），属于非跨膜蛋白。SMART 预测显示该蛋白的139～414 区域为吡哆醛结合域Orn_Arg_deC_N（图3-C），与精氨酸脱羧酶功能密切相关[21]。
图3 砂糖橘CrADC 蛋白的生物信息学分析
Fig.3 Bioinformatics analysis of CrADC protein in Shatangju
A.蛋白二级结构；B.蛋白跨膜结构域；C.蛋白结构域。
A.The secondary structure of the protein;B.Ransmembrane domain of the protein;C.Analysis result of the protein domain.
为分析果树ADC基因间进化关系，从NCBI数据库中选取15种果树ADC蛋白与CrADC进行序列比对分析。双序列比对表明砂糖橘CrADC与甜橙（C.sinensis，XP_006487299.2）、克里曼丁橘（C.clementina，XP 006423501.1）、枳（C. trifoliata，AEE99192.1）的ADC蛋白序列高度相似，序列一致性超过96.5%，与香蕉（Musa acuminata，XP_009393201.1）ADC 蛋白序列一致性最低（62.0%）。多序列比对（图4）显示，16 种果树的ADC 蛋白序列相似性较高，均包含一个完整的吡哆醛结合域Orn_Arg_deC_N，该结构域的氨基酸序列高度保守，表明果树进化过程中ADC蛋白作为关键酶促蛋白，氨基酸序列较保守。
图4 砂糖橘CrADC 与其他果树ADC 蛋白多序列比对结果
Fig.4 Multiple alignment of Shatangju CrADC and other fruit tree ADC proteins
下划线部分为吡哆醛结合域Orn_Arg_deC_N。
The underlined part was the pyridoxal binding domain Orn_Arg_deC_N.
2.3 CrADC蛋白进化分析
系统进化分析（图5）显示，16种果树的ADC蛋白聚为三类。其中芸香科柑橘属的甜橙、克里曼丁橘、枳、砂糖橘，以及杧果（Mangifera indica，XP_044488993.1）、番木瓜（Carica papaya，XP_021889268.1）6 种果树ADC蛋白聚为一类，是主要起源于亚热带或热带地区的果树，处于同一进化分支。蔷薇科的甜樱桃（Prunus avium，XP_021806331.1）、桃（Prunus persica，XP_007200307.1）、李（Prunus dulcis，XP_034226752.1）、苹果（Malus domestica，XP_008358425.2），以及葡萄科的葡萄（Vitis riparia，XP_034681234.1）、鼠李科的枣（Ziziphus jujuba，XP_015892431.2）等果树ADC蛋白聚为一类，是主要起源于温带地区的落叶型果树，处于同一进化分支。芭蕉科的香蕉（Musa acuminata，XP_009393201.1）与杜鹃花科的蓝莓（Vaccinium darrowii，KAH7835244.1）与其他ADC 蛋白差异较大，被聚为一类。
图5 16 种果树ADC 蛋白的系统进化树
Fig.5 Phylogenetic tree of ADC proteins from 16 fruit trees species
2.4 砂糖橘CrADC基因表达分析
对砂糖橘不同组织CrADC 基因的qPCR 结果（图6）显示，CrADC基因在砂糖橘春梢期嫩叶、越冬期老叶、花、30 d幼果果皮和30 d幼果果肉等组织中均有表达，且除嫩叶与花外，其他组织间基因表达差异均达到显著水平。以30 d 幼果果皮的表达量最高，其次是嫩叶和花，老叶中基因表达量最低。进一步比较发现，30 d幼果果皮表达量是果肉的3.18倍，春梢期嫩叶表达量是越冬期老叶的3.41 倍，表明CrADC基因在叶片生长的不同时期，以及果实不同部位的基因表达量具有显著差异，表现出基因表达的时空特异性，这可能与CrADC基因参与的生理调控功能或多胺区域化分布差异有关。
图6 CrADC 基因在砂糖橘不同组织中的表达水平
Fig.6 Expression level of CrADC in different tissues of Shatangju
不同字母表示不同组织间的差异显著（p＜0.05）。
Different lowercase letters indicate significant differences between tissues(p＜0.05).
为研究CrADC基因在干旱胁迫时的表达特征，利用10%的PEG-6000 溶液来模拟干旱胁迫环境。剪取6 年生新发秋梢进行干旱胁迫处理，并于3、6、9、12、24、36 h提取叶片总RNA进行相对定量qPCR分析，以0 h 为对照。试验结果（图7）显示，随着干旱胁迫时间的延长，CrADC 基因表达量也相应上升，并在处理24 h 时达到最高，其表达量是0 h 对照的3.82 倍。当干旱胁迫继续延长后，其基因表达量开始下降，处理36 h 时表达量仅为最高24 h 时的59.5%。该结果表明，砂糖橘在干旱胁迫24 h内，可显著提高CrADC基因的表达量，推测该基因的高表达将促进腐胺等PAs 的合成来适应干旱胁迫，上述推测还有待于进一步试验验证。
图7 干旱胁迫处理的砂糖橘CrADC 基因表达水平
Fig.7 Expression level of CrADC of Shatangju under drought stress
不同字母表示不同处理间的差异显著（p＜0.05）。
Different lowercase letters indicate significant differences between treatments(p＜0.05).
2.5 CrADC基因转化烟草研究
将含有pBI121-CrADC 重组质粒的农杆菌GV3101，通过叶盘法转化烟草，经Kan 抗性筛选后获得25 个转基因抗性植株。利用扩增片段包括载体与目的基因序列的特异性引物TranPCR-F/Tran-PCR-R进行PCR检测，结果发现18株转基因抗性植株中检测到特异性条带（图8），表明CrADC 基因已整合到烟草基因组中。
图8 部分转CrADC 基因烟草植株的PCR 结果
Fig.8 PCR results of transgenic tobacco plants with CrADC gene
M.Marker DL2000；1.阳性对照（含pBI121-CrADC 质粒的GV3101 农杆菌）；3.阴性对照（非转基因烟草）；2，4～10.转CrADC 基因抗性植株。
M. Marker DL2000; 1. Positive control (Agrobacterium GV3101 with pBI121-CrADC plasmid); 3. Negative control (Non-transgenic tobacco plant);2,4-10.Transgenic tobacco plants with CrADC.
为了检测CrADC 基因在转基因烟草中的表达情况，分别提取转基因烟草和对照非转基因烟草的根、茎、叶组织总RNA，经反转录cDNA 后进行qPCR 实验，以烟草actin 为内参基因。结果显示（图9），CrADC基因在转基因烟草的根、茎、叶组织中均能表达，以烟草嫩叶中表达量最高，其次为根系，茎组织表达量最低，而非转基因对照的组织中未检测到该基因表达水平。
图9 CrADC 基因在转基因烟草植株中的表达水平
Fig.9 Expression level of CrADC gene in transgenic plants
对照为非转基因烟草，其他为转基因烟草的根、茎、叶组织，不同字母表示不同组织间的差异显著（p＜0.05）。
Control was non-transgenic tobacco; plant, root, stem and leaf were transgenic tobacco, different lowercase letters indicate significant differences between tissues(p＜0.05).
2.6 转基因烟草抗旱性分析
对上述转基因T0代植株，进行续代、筛选鉴定后获得一批T3代纯合株系。对T3代纯合株系进行表达分析，筛选出1个CrADC基因表达量最高的株系11-2a开展抗旱性分析。选取该转基因株系和对照烟草正常生长30 d后，剪取叶片进行自然脱水处理后，并于不同时间段取样测定失水率，结果见图10。由图10可知，在120 min内转基因系的失水率在不同时间段都低于对照普通烟草。该结果表明CrADC基因在烟草中超表达后，表现出明显的抗脱水性。
图10 转基因系及对照烟草的失水率
Fig.10 Rates of water loss in transgenic tobacco lines and control
对照为普通烟草，转基因系为超表达的转CrADC 株系11-2a。
Control was non-transgenic tobacco, transgenic line was over expressed transgenic lines 11-2a.
进一步对转基因系和对照烟草进行20 d的干旱胁迫处理，并分别测定衡量细胞膜通透性的电导率、丙二醛含量指标，以及清除过氧化氢、活性氧的抗氧化酶活性，相关结果见图11。由图11-A～B可知，转基因系的电导率和丙二醛含量均低于对照普通烟草，两者间差异分别达到显著和极显著水平，表明超表达CrADC的转基因系能降低叶片细胞膜通透性，从而表现出较高的抗旱性。由图11-C～D可知，转基因系的CAT酶和SOD酶活性均高于对照烟草，两者间差异均达到极显著水平，表明在干旱胁迫后，转基因系提高了叶片的抗氧化酶活性，更能有效清除体内活性氧，避免转基因植株的生理损伤，从而表现较强的抗旱性。
图11 干旱胁迫下转基因系及对照烟草的抗旱生理指标
Fig.11 Drought resistance traits in transgenic tobacco lines and control under drought stress
对照为普通烟草，转基因系为超表达的转CrADC 株系11-2a。**和*分别表示两者间差异达到极显著（p＜0.01）和显著水平（p＜0.05）。
The control was non-transgenic tobacco,transgenic line was over-expressed transgenic lines 11-2a.The asterisks on the bars indicate a value that is significant differences(**,p＜0.01；*,p＜0.05).
3 讨 论
PAs 是生物体普遍存在的一类低分子脂肪族含氮碱，在柑橘属植物的细胞分化、根系建成、成花过程、果实发育、气孔调节和气体交换等生理代谢活动中发挥重要作用[4]。ADC 作为PAs 生物合成途径中的第一个关键限速酶，能通过调控PAs合成速率来调节植物代谢活动，降低逆境胁迫对植物生长的不利影响[22]。目前在柑橘属PAs 合成途径的相关基因中，仅报道了甜橙（C.sinensis）Cs-SAMDC[23]、砂糖橘CsSAMDC[14]，以及枳（C.trifo-liata）PtADC[10]的基因克隆相关研究，柑橘属广泛栽培的其他柑、橘、橙、柚等物种的ADC基因克隆及相关功能研究尚未报道。本研究克隆了砂糖橘CrADC 基因，与Wang 等[10]报道的枳PtADC（AEE99192.1）的氨基酸序列一致性为96.5%，均含有一个序列高度保守的吡哆醛结合域Orn_Arg_deC_N（PF02784），与精氨酸脱羧酶功能密切相关[21]。对16种果树ADC蛋白进化分析显示，起源于温带的苹果、李、枣、葡萄等8种落叶果树为一个进化分支，起源于热带或亚热带的柑橘、杧果、番木瓜等6种果树属于另一分支。表明在果树进化过程中ADC 蛋白作为关键酶促蛋白，氨基酸序列较为保守。
前人研究发现，果树ADC 基因在植物根、茎、叶、果实等多个组织中均能表达，在杜梨的叶片中表达量最高，而在枳的果皮中表达量最高，在一定脱水时间内果树ADC基因相对表达量会上升[10，13]。本研究CrADC 基因在砂糖橘的叶、花、果等组织中均有表达，以30 d幼果果皮的表达量最高。在干旱胁迫的24 h内，CrADC基因表达量随时间延长也相应稳步上升，与枳[10]、桃树[12]、杜梨[13]等果树在脱水环境下的ADC基因表达特征基本相似。Miller等[24]报道干旱胁迫会诱导植株体内活性氧积累，从而造成细胞膜损伤。PAs作为渗透调节剂具有保护酶活性和降低丙二醛含量，清除体内活性氧自由基，增强植物的抗干旱胁迫能力的功能[25]。Shi 等[6]和Zhang 等[26]研究发现干旱或脱水会导致植物叶片气孔保卫细胞中的PAs浓度上升，而天然PAs会强烈抑制气孔开放、诱导气孔关闭，植物气孔关闭能减少水分蒸发及电解质流失，从而保持植株在干旱环境下正常生长。在根系建成中，PAs 能充当细胞增殖分化等激素的第二信使，通过控制生长素/细胞分裂素的比率，从而诱导根系发育[27]。Yao 等[7-8]发现外施PAs 能增加黎檬（C.limonia）的根长、根系表面积、根体积和根尖数，增强根系吸水能力，缓解干旱胁迫。本研究中，筛选出的转CrADC 基因烟草在自然脱水处理后，其叶片相较于对照烟草表现出明显的抗脱水性。在20 d干旱胁迫后，转基因系的电导率、丙二醛含量均低于对照，表现出更低的细胞膜通透性；其CAT 酶、SOD 酶活性均高于对照，表现强抗氧化酶活性从而避免细胞膜损伤，表现出更好的植株抗旱性。通过基因表达水平和转基因烟草功能分析，笔者推测柑橘在干旱胁迫的诱导下，CrADC基因高表达后促进腐胺等PAs 合成，PAs 可调节细胞内渗透物质含量，增强吸水性，同时PAs具有保护抗氧化酶活性，清除活性氧而减轻膜脂过氧化程度。高浓度PAs 能导致叶片保卫细胞控制气孔关闭，同时PAs作为第二信使促进根系发育而增强吸水能力，从而缓解干旱胁迫对植物生长的不利影响。上述假设还有待于SPMS、SPDS 等PAs 合成途径基因的克隆及表达特征分析，并继续开展干旱胁迫下砂糖橘内源PAs 浓度和气孔闭合、根系生长发育等表型的关联性分析，从而为探究CrADC等基因通过调控PAs合成代谢，抵御干旱等非生物胁迫的生理机制提供分子生物学证据。
4 结 论
克隆了砂糖橘CrADC 基因，其全长2262 bp，编码753 个氨基酸，属起源于亚热带或热带果树的进化分支。CrADC 基因在砂糖橘叶、花、果等组织中均能表达，但不同时期叶片和果实不同部位的表达量均有显著差异，在干旱胁迫24 h 内基因表达量随时间延长而逐步上升，转基因系比对照烟草有更好的抗旱生理特性。
[1] 区善汉，莫健生，张社南.广西沙糖橘产业发展存在的问题与对策[J].南方园艺，2014，25(5)：28-30.OU Shanhan，MO Jiansheng，ZHANG Shenan. Problems and countermeasures in the development of Guangxi sugar orange industry[J].Southern Horticulture，2014，25(5)：28-30.
[2] 李果果，陈香玲，秦荣耀，刘要鑫，赵小龙，孙宁静，欧智涛，唐志鹏，张广珍.大果沙糖橘的遗传鉴定及引种栽培表现[J].南方农业学报，2018，49(6)：1171-1176.LI Guoguo，CHEN Xiangling，QIN Rongyao，LIU Yaoxin，ZHAO Xiaolong，SUN Ningjing，OU Zhitao，TANG Zhipeng，ZHANG Guangzhen. Genetic identification and cultivation performance of introduced Daguo shatangju[J]. Journal of Southern Agriculture，2018，49(6)：1171-1176.
[3] 龚成宇，王毅，宋海岩，杨科，陶海青，刘俊宏，龚荣高.干旱胁迫对黄果柑果实品质及糖酸代谢酶活性的影响[J].西南农业学报，2021，34(2)：272-278.GONG Chengyu，WANG Yi，SONG Haiyan，YANG Ke，TAO Haiqing，LIU Junhong，GONG Ronggao. Effects of drought stress on fruit quality and enzyme activity of glycolic acid metabolism in Huangguogan fruit[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2021，34(2)：272-278.
[4] KILLINY N，NEHELA Y. Citruspolyamines：structure，biosynthesis，and physiological functions[J].Plants，2020，9(4)：426.
[5] YANG J C，ZHANG J H，LIU K，WANG Z Q，LIU L J.Involvement of polyamines in the drought resistance of rice[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58(6)：1545-1555.
[6] SHI J，FU X Z，PENG T，HUANG X S，FAN Q J，LIU J H.Spermine pretreatment confers dehydration tolerance of citrus in vitro plants via modulation of antioxidative capacity and stomatal response[J].Tree Physiology，2010，30(7)：914-922.
[7] YAO Q，WANG L R，CHEN J Z，ZHU H H.The effects of polyamines on root morphology and arbuscular mycorrhiza of citrus seedlings[J].Acta Horticulturae，2008，774：151-158.
[8] YAO Q，WANG L R，XING Q X，CHEN J Z，ZHU H H.Exogenous polyamines influence root morphogenesis and arbuscular mycorrhizal development of Citrus limonia seedlings[J]. Plant Growth Regulation，2010，60(1)：27-33.
[9] PRIMIKIRIOS N I，ROUBELAKIS-ANGELAKIS K A. Cloning and expression of an arginine decarboxylase cDNA from Vitis vinifera L. cell-suspension cultures[J]. Planta，1999，208(4)：574-582.
[10] WANG J，SUN P P，CHEN C L，WANG Y，FU X Z，LIU J H.An arginine decarboxylase gene PtADC from Poncirus trifoliata confers abiotic stress tolerance and promotes primary root growth in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany，2011，62(8)：2899-2914.
[11] 吴昊.柑橘转录因子CsCBF1 和PtrNAC72 在调控精氨酸脱羧酶基因表达及抗逆中的功能鉴定[D].武汉：华中农业大学，2017.WU Hao. Functional characterization of Citrus sinensis CBF1 and Poncirus trifoliata NAC72 in regulation ofarginine decarboxylase gene expression and stress tolerance[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University，2017.
[12] 王保全，张晓娜，刘继红，李国怀.桃树PpADC 基因克隆及逆境胁迫表达分析[J].西南师范大学学报(自然科学版)，2020，45(7)：34-41.WANG Baoquan，ZHANGXiaona，LIU Jihong，LI Guohuai.Cloning and abiotic stress-induced expression of the arginine decarboxylase gene from Prunus persica[J]. Journal of Southwest China Normal University (Natural Science Edition)，2020，45(7)：34-41.
[13] 靳丛，郭巧会，陈国栋，孙小川，孙敏，周瑾，王纪忠，黄小三.杜梨精氨酸脱羧酶基因PbADC 的克隆与表达分析[J].核农学报，2021，35(2)：306-313.JIN Cong，GUO Qiaohui，CHEN Guodong，SUN Xiaochuan，SUN Min，ZHOU Jin，WANG Jizhong，HUANG Xiaosan.Cloning and expression analysis of PbADC in Pyrus betulifolia[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2021，35(2)：306-313.
[14] 唐文武，吴秀兰.沙糖橘S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因克隆及表达分析[J].南方农业学报，2020，51(6)：1369-1376.TANG Wenwu，WU Xiulan. Cloning and expression analysis of S-adenosylmethionine decarboxylase gene(CrSAMDC)in Shatangju[J]. Journal of Southern Agriculture，2020，51(6)：1369-1376.
[15] WU X, QIN Y H, HU G B.Cloning and expression analysis of self-incompatibility S1 family protein gene in Citrus reticulata Blanco cv. Wuzishatangju[J]. Research Journal of Biotechnology,2015,10(7):19-25.
[16] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- ΔΔCT method[J].Methods，2001，25(4)：402-408.
[17] HORSCH R B，FRY J E，HOFFMANN N L，EICHHOLTZ D，ROGERS S G，FRALEY R T.A simple and general method for transferring genes into plants[J]. Science，1985，227(4691)：1229-1231.
[18] FAIZE M，FAIZE L，BURGOS L. Using quantitative real-time PCR to detect chimeras in transgenic tobacco and apricot and to monitor their dissociation[J].BMC Biotechnology，2010，10：53.
[19] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000.LI Hesheng.Principles and techniques of plant physiological biochemical experiment[M].Beijing：Higher Education Press，2000.
[20] WU H，FU B，SUN P P，XIAO C，LIU J H.A NAC transcription factor represses putrescine biosynthesis and affects drought tolerance[J].Plant Physiology，2016，172(3)：1532-1547.
[21] MEHTA P K，CHRISTEN P. The molecular evolution of pyridoxal-5’-phosphate-dependent enzymes[J]. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology，2000，74：129-184.
[22] WI S J，KIM S J，KIM W T，PARK K Y.Constitutive S-adenosylmethionine decarboxylase gene expression increases drought tolerance through inhibition of reactive oxygen species accumulation in Arabidopsis[J].Planta，2014，239(5)：979-988.
[23] WANG J，LIU J H，KUROSAWA T，NADA K，BAN Y，MORIGUCHI T. Cloning，biochemical identification，and expression analysis of a gene encoding S-adenosylmethionine decarboxylase in navel orange (Citrus sinensis Osbeck)[J]. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2010，85(3)：219-226.
[24] MILLER G，SUZUKI N，CIFTCI-YILMAZ S，MITTLER R.Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses[J]. Plant，Cell & Environment，2010，33(4)：453-467.
[25] 李霞，程运河，马晓东，韩蕾，孙振元.多胺在植物抗逆中的生理机制[J].世界林业研究，2018，31(4)：23-28.LI Xia，CHENG Yunhe，MA Xiaodong，HAN Lei，SUN Zhenyuan.Physiological mechanism of polyamines in plant resistance[J].World Forestry Research，2018，31(4)：23-28.
[26] ZHANG Q H，WANG M，HU J B，WANG W，FU X Z，LIU J H.PtrABF of Poncirus trifoliata functions in dehydration tolerance by reducing stomatal density and maintaining reactive oxygen species homeostasis[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66(19)：5911-5927.
[27] CUI X，GE C M，WANG R X，WANG H Z，CHEN W Q，FU Z M，JIANG X N，LI J Y，WANG Y H. The BUD2 mutation affects plant architecture through altering cytokinin and auxin responses in Arabidopsis[J].Cell Research，2010，20(5)：576-586.