柑橘是世界第一大类水果，也是我国南方栽培面积最广的果树，在我国的农业和国民经济中占据十分重要的地位[1]。据统计，从2007年起，我国的柑橘种植面积和产量均已超过巴西，跃居全球第一位，成为世界第一大柑橘生产国[1-2]。然而，柑橘生产过程中会遭受许多病害，这些病害直接威胁着柑橘产业的发展。
柑橘黄龙病（Huanglongbing，简称HLB）是柑橘生产中最具毁灭性的病害，由一种局限于韧皮部筛管细胞的革兰氏阴性细菌引起，该菌归属于原核生物、薄壁菌门、α-变型菌纲（Proteobacteriacea）的候选韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter spp.）[3]，可导致叶片斑驳、发黄、缺锌叶脉枯萎、枝条枯死、生长迟缓、抑制新根生长、变小、变绿等症状[4]。其致病机制为：先引起柑橘韧皮部组织坏死和筛管堵塞，进而导致光合产物从源器官（主要为成熟叶）到库器官（如嫩叶、幼果和根等）的运输受阻，最后造成植株代谢紊乱、衰退直至死亡[5]。目前共发现3个黄龙病菌种：亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus，简称CLas）、非洲种（Candidatus Liberibacter africanus，简称CLaf）和美洲种（Candidatus Liberibacter americaus，简称CLam），其中亚洲种是目前分布最广的，我国黄龙病菌皆为亚洲种[3,6]。3 种病菌都可在22~24 ℃致病，其中非洲种为热敏型，在30 ℃以上症状减轻或消失[7]。美洲种与亚洲种为耐热型，前者在24 ℃滴度很高，在32 ℃以上几乎无法存活，而后者存活温度超过30 ℃，并且在32 ℃和35 ℃有着高滴度，但在38 ℃时滴度不高[8]。黄龙病菌主要通过木虱和带病接穗嫁接传播，具有蔓延速度极快、传播范围广、危害极大、尚无根治措施等特点，给柑橘产业的发展带来极其严重的经济损失[2，9-10]。
目前黄龙病的研究方向大而广，可涉及病原体、寄主抗性评价、防治药剂、基因编辑、检测方法、防控策略等多个方面。面对其海量的文献数据，若想系统、精准地了解该病害的研究现状及发展趋势，最好的方法是利用CiteSpace 对其进行统计分析。CiteSpace 是陈超美开发的一款引文可视化分析软件，用于分析科学文献中蕴含的潜在知识[11]。该软件的工作原理基于共引分析理论和寻径网络算法，可对特定领域的文献进行信息分析和数据挖掘，从而得到各种科学的知识图谱，进而直观地展示某领域的研究热点及前沿[12]。基于此，笔者在本文中采用信息可视化分析工具CiteSpace（版本号5.8.R3），以CNKI（1956-2021）和Web of Science（WOS）核心合集（2002-2021）为数据源，对中英文黄龙病研究文献进行数据提取、计量分析，归纳两者的热点与前沿，以期了解最新的国际研究动态，为我国黄龙病的研究提供参考。
1 数据来源和研究方法
1.1 中文文献数据
在中国知网数据库中，鉴于以往不同国家和地区对黄龙病的命名不一致的情况[13]，笔者在本文中采用高级检索的方式，以“黄龙病+黄梢病+青果病+梢枯病”为主题词进行检索，设置截止时间为2021年12月31日，取消勾选“中英文扩展”，得到2021年12 月31 日以前（包含）发表的有关结果共2910 条，然后选择“学术期刊”，保留期刊文献2359 篇，最后将文献的标题、作者、机构、摘要、关键词等题录信息批量导出为Refworks格式的纯文本文件，即中文文献数据。
1.2 英文文献数据
在Web of Science核心数据库中，笔者在本文中以“TS=(Huanglongbing) OR TS=(Yellow shoot disease) OR TS=(Citrus greening) OR TS=(Likubing)OR TS=(Vein phloem degeneration) OR TS=(Leaf mottle)OR TS=(Dieback)”为检索式进行检索，截止时间设置为2021年12月31日，得到2021年12月31日以前（包含）发表的有关结果2378 条。在文献类型中勾选“论文”及“综述论文”进行精炼，保留论文及综述论文共2108 篇，选择文献的“全记录与引用的参考文献”，批量导出为纯文本格式文件，即可得到英文文献数据。
1.3 研究方法
笔者在本文中使用Excel及可视化软件CiteSpace软件对从CNKI与WOS检索获得的黄龙病研究相关文献，从发文趋势、研究主体（包括作者、机构、国家）、研究热点、研究前沿等4个角度，进行发文量统计、研究主体共现、关键词共现及聚类、突现词探测，并进行对比分析。
2 研究结果及分析
2.1 发文量统计
笔者在本文中对CNKI 和WOS 数据库收录的黄龙病相关文献进行检索并筛选，分别以中文发文量和英文发文量进行分析，具体如下。
2.1.1 中文文献发文量 在1956—2021 年这66 年间，从CNKI 数据库筛选出来的黄龙病相关文献共2359篇，年均发文量约35.74篇，年度发文趋势如图1所示。
图1 中文文献柑橘黄龙病年度发文趋势
Fig.1 Trends of annual publications of citrus Huanglongbing from Chinese literature
根据图1 可划分为3 个阶段。1956—1978 年间为起步阶段，该阶段的年度发文量均在10 篇以下，23 年间总发文量为62 篇，年均发文量不足2 篇，甚至连续5 a（年）（1967—1971）的发文量为0。1979—2001 年间为发展阶段，整体呈现稳步增长趋势，少数年份出现回落，年度发文量保持在10 篇以上，最高达到30篇（1996年），总发文量为379篇。2002—2021 年为快速阶段，年均发文量为95 篇，2016 年度达到了185 篇的峰值。快速阶段的发文量总共为1903 篇，占据CNKI 总文献数的80.67%，说明近年来，我国比以往更加重视黄龙病的防治工作，预计未来黄龙病的研究热度仍会继续保持。
2.1.2 英文文献发文量 在2002—2021 年这20 年间，WOS核心数据库收录的黄龙病相关文献共2108篇，年均发文量约106 篇，年度发文趋势如图2 所示。黄龙病英文文献的发文量整体呈现上升趋势，少数年份出现回落。2021年年度发文量达到了历史峰值，为266篇，说明国际力量正不断加强对黄龙病的研究。
图2 英文文献柑橘黄龙病年度发文趋势
Fig.2 Trends of annual publications on citrus Huanglongbing from English literature
2.2 研究主体分析
2.2.1 作者分析 对从CNKI获得的数据进行作者（Author）分析，绘制得到可视化图谱，如图3（左）所示。图中共出现了1108 个节点，1940 条连线，其中节点数为对象数，节点越大，表明该对象的文章数量越多；节点之间的连线越粗，表明两个对象之间的合作关系越密切。根据普赖斯定律，核心作者的认证公式为
，其中Nmax为发文最多的作者发文量，M为核心作者的最低文献数[14]。经计算，
，因此该领域发文数不少于6篇的作者为核心作者。结合图和有关数据可以看出，当前国内黄龙病领域的研究人员呈现出“流线型”，形成了以柯冲（福建省农业科学院，47篇，排名第一）、邱柱石（广西柑橘研究所，43篇，排名第二）、邓晓玲（华南农业大学，37 篇，排名第三）等作者为核心的作者群和合作网络，和少数独立的作者。
图3 中、外文作者共现网络
Fig.3 Co-occurrence network of Chinese and foreign authors
对从WOS 获得的数据进行作者（author）分析，绘制作者合作网络图谱，如图3（右）所示。图中共出现了715个节点，1378条连线。根据普赖斯定律，可计算出发文量7篇及以上的为核心作者。结合图和有关数据，可看出“蛛网型”合作网络密集分布，形成了以DAVID G HALL（美国农业部农业研究局，美国园艺研究实验室，80 篇，排名第一）、LUKASZ L STELINSKI（美国佛罗里达大学昆虫学和线虫学教授，77篇，排名第二）、NABIL KILLINY（美国佛罗里达大学植物病理学副教授，63篇，排名第三）等高产作者为核心的作者群及合作网络。
2.2.2 机构分析 对从CNKI获得的数据进行机构（institution）分析，绘制得到可视化图谱，如图4（左）所示。图中共出现了767个节点，282条连线。由图及有关数据可以看出，广西柑橘研究所（广西桂林，94 篇，位列第一）、中国农业科学院柑橘研究所（又称“西南大学柑橘研究所”，重庆市，49 篇，位列第二）、浙江省台州市黄岩区植物检疫站（浙江台州，26篇，位列第三）、浙江省柑橘研究所（浙江台州，23篇，位列第四）、国家脐橙工程技术研究中心（江西赣州，17篇，位列第五）等机构周围形成了较为密集的合作网络，同省份的地区的机构合作较为紧密，多数机构的关系呈现出独立、两两联系的形式。
图4 国内（左）与国际（右）柑橘黄龙病研究机构合作网络
Fig.4 Cooperation network of domestic(left)and international(right)citrus Huanglongbing research institutions
对从WOS 获得的数据进行机构（institution）分析，绘制得到可视化图谱，如图4（右）所示。图中共出现了617 个节点，1215 条连线。结合图和有关数据可看出，当前国际黄龙病领域的研究机构较多，整体呈现为密集的蛛网状合作网络，形成了以佛罗里达大学（Univ Florida，美国，580篇，位列第一）、ARS（美国农业科学研究院，美国，201篇，位列第二）、美国农业部农业研究局（USDA-ARS，美国，195 篇，位列第三）、圣保罗大学（Univ Sao Paulo，巴西，94 篇，位列第四）、华南农业大学（South China Agr Univ，中国，75 篇，位列第五）、西南大学（Southwest Univ，中国，73 篇，位列第六）等机构为主要核心的合作关系，并向四周延展开。
进一步获取CiteSpace中机构分析的有关数据，截取发文量30 篇以上的高产机构共12 个。其中有6个机构属于美国，4个机构属于中国，2个机构属于巴西。12个机构中，中国机构的总发文量为225篇，巴西机构的总发文量为133 篇，而美国机构的总发文量为1129篇，是中国机构和巴西机构的发文量总和的2.15 倍，占据WOS 数据库总发文量（2108 条）的53.56%。可以初步判断出，我国机构虽已成为国际黄龙病研究领域的重要力量，但其科研实力与美国相比，仍存在较大差距。
2.2.3 国家分析 对从WOS 获得的数据进行国家（country）分析，绘制得到可视化图谱，如图5 所示。图中共出现了83 个节点，386 条连线。根据在CiteSpace中获取国家分析的有关数据，截取发文量排名前10位的国家发文信息，然后汇总并制作成表格，如表1所示。
表1 国际柑橘黄龙病研究发文量排名前10 的国家
Table 1 Top 10 countries in terms of the number of articles published on international citrus Huanglongbing research
中介中心性Betweeness centrality 0.72 0.22 0.16 0.16 0.05 0.03 0.09 0.03 0.23 0.03国家Country发文量/篇Articles No.美国USA中国China巴西Brazil西班牙Spain墨西哥Mexico印度India意大利Italy日本Japan澳大利亚Australia巴基斯坦Pakistan 1062 475 255 122 84 68 67 58 53 49首次发文年份Year of first publication 2002 2004 2003 2002 2011 2004 2002 2002 2003 2003
图5 国际柑橘黄龙病研究国家合作网络
Fig.5 National cooperation network of international citrus Huanglongbing research
由表1 可以看出，当前国际上已有较多国家在黄龙病领域展开了相关研究，呈现出以美国（USA）、中国（China）、巴西（Brazil）等国家为核心的较为密集的合作网络，可见国家之间存在深度的合作关系。此外，美国以1062篇的发文量遥遥领先于其他国家，占据WOS数据库总发文量的50.38%，比第二名（中国，475 篇）和第三名（巴西，255 篇）的总和还多出332篇，可见美国的黄龙病科研实力强劲。
具有高中介中心性的文献通常是连接两个不同领域的关键枢纽[11]，当某节点的中介中心性≥0.1时，该节点为关键节点。一个节点的中介中心性越高，表明其在网络中的连接程度越强，科研影响力越大[15]。美国的中介中心性以0.72 排名第一，比中国（第三名，0.22）还多0.5。澳大利亚（Austraila）的发文量虽只有53 篇，排名第九，其中介中心性却以0.23 排名第二。综上，美国的黄龙病研究的影响力在全球最强，澳大利亚与中国次之。
美国相关科研成果的全球影响力虽然大，但实际防控效果很差。据统计，佛罗里达州的甜橙产量由2005—2006 年的1.5 亿箱下降至2019 年的7200万箱[9]。2021年2月，美国批准使用涕灭威防控柑橘黄龙病，但早在2003 年，涕灭威就因对人类造成健康问题而被欧盟禁用，中国自2020年10月1日起禁止含涕灭威的产品在境内销售和使用[16]。澳大利亚并无黄龙病的困扰，其研究角度是仅从检疫角度加以重视的，也难以说明该国的相关研究水平比中国高。虽然中国的发文量及质量不如美国，中介中心性稍差于澳大利亚，但应用下三项基本措施的实际防控效果是喜人的，全国的柑橘产量由2000年的878.31万t持续增长至2021年的5 121.9万t[17-18]，与美国形成了鲜明的对比，是生产防控和科研攻关相协调的体现。
2.3 研究热点
2.3.1 中文文献研究热点 关键词能够反映一篇文章的内容，凝练了最核心、最关键的信息，能协助了解到该领域的研究热点。对从CNKI获得的数据进行关键词（keyword）分析，然后选择Pathfinder算法，对同义词进行合并，生成关键词共现图谱。根据图谱截取频次大于25的高频关键词信息，再选择LLR（Log-likelihood Ratio）算法，对关键词进行聚类，得到15 个有效聚类标签，最后将聚类结果可视化展示，如图6（左）所示。
图6 国内（左）与国际（右）柑橘黄龙病研究关键词聚类图
Fig.6 Cluster diagram of key words in domestic(left)and international(right)citrus Huanglongbing research
15 个聚类标签有：栽培技术（#0）、柑橘木虱（#1）、黄龙病（#2）、柑橘（#3）、黄化病（#4）、初步研究（#5）、青果病（#6）、温州蜜柑（#7）、柑橘生产（#8）、植物检疫（#9）、吸果夜蛾（#10）、种群动态（#11）、红江橙（#12）、墨西哥（#13）、早结丰产（#14）。根据关键词聚类图，进一步剔除与黄龙病无关的关键词，再将中文文献的黄龙病研究热点归纳为以下两个方面：
（1）黄龙病综合防治的相关研究。1）目前我国的综合防控按照20 世纪80 年代初我国农业部组织多个研究小组所总结出来的三项必要措施，具体为：灭杀柑橘木虱、使用无毒繁殖材料、及时铲除病原（树）进行综合防治，其中防控柑橘木虱是关键措施，对此可建立生态隔离系统：种植乔木、灌木、杉木等树种作为防护隔离林带（切忌种植木虱寄主植物），以及利用天然或物理生态屏障来阻断木虱大规模扩散[19-20]；在气候变暖的影响下，木虱适生区正在北移，预计在2081—2100 年，其生活北界将由北纬30° N转移至32°~37° N，应加强早期预警和检疫防控措施[21-22]；目前防控柑橘木虱的方法以化学防治（杀虫剂）为主，也有研究提出采用绿色环保的生物防治，即通过投放捕食性天敌和寄生性天敌昆虫和微生物，如跳小蜂、啮小蜂、六斑月瓢虫等，以及其他物理防治措施，如杀虫灯、黄色粘虫板、性诱剂、糖醋液和诱蝇球等，这些物理措施在我国湖南部分地区已投入使用，可尝试用于其他地区[23-25]。2）治疗药剂：现今的药剂以防治为主，暂无特效药；土霉素可有效抑制黄龙病菌亚洲种，可减少柑橘叶片内的淀粉含量，增加柑橘产量，也未对果实品质产生显著影响[26]；磺胺二甲氧嘧啶钠盐（sulfadimethoxine sodium salt，SDM）对黄龙病（以纽荷尔脐橙为对象）有一定的抑制效果[27]；对柑橘树干注射1 g·L-1的盐酸四环素能够显著降低黄龙病菌浓度，但经叶面喷施和根际浇灌盐酸四环素的方式防治效果不明显[28]。3）其他治疗手段：在研究早期，以林孔湘为代表的科研人员对黄龙病的治疗开展了一系列的初步研究，发现湿热空气热处理可致使病菌钝化甚至死亡，且植物活力不受影响，之后热处理的方式发展成：温控箱、热空气、热水蒸汽、可透太阳光的田间移动温室（国外）、远红外、微波等，但上述实验尚无田间规模应用的条件，而多用于无毒幼苗的培育[29-33]。除了热处理，还有：a.利用一些化学分子诱导或激发柑橘内部抗病；b.以寡糖为植物免疫识别、以纳米碘为靶向消杀黄龙病菌的疫苗研制思路，对病树处理后可达到PCR转阴率50%的效果，但仅停留在试验阶段[10]；c.利用茎尖嫁接脱毒：依据病毒在植物体内分布不均匀性原理，将顶端分生组织不带毒区域切下并嫁接到健康砧木上进行培育获得无病毒植株[34]，是20世纪80年代以来应用最广，也是迄今最为有用的技术。
（2）黄龙病原体的相关研究：1）病原体分布：CLas在病枝中分布不均匀，在果实处（橘络、果中轴或种皮）富集[35]；柑橘花器中的花瓣、雄蕊、雌蕊和花粉以及种子中的种皮和胚乳组织均可检测到CLas，但未发现播种和授粉可传播HLB[36]；广东黄龙病菌以Type-2 原噬菌体类型和Type-1+3 混合原噬菌体类型为主，前者比后者更容易在柑橘木虱成虫体内增殖，对柑橘也具有更强的致病力[37]。2）黄龙病原体的检测技术：掌上纳米孔测序仪MinION：可弥补因柑橘木虱虫体过小或损坏难以进行光学识别的不足；可视化LAMP 快速检测技术：具有成本低、30 min即可观察到检测结果、操作简便、准确性高等优点，有望替代qPCR 在田间进行黄龙病的快速鉴定；基于串联重复序列的柑橘黄龙病菌聚合酶链式置换反应（TR-PCDR）检测技术，该技术的检测灵敏度比基于SYBR Green 的实时荧光定量PCR 高10倍，已大规模应用于广西全区柑橘样品的黄龙病菌检测[36，38-39]。3）离体培养：国内外均有黄龙病菌成功分离纯培养的报道，但未完成科赫氏法则检验，也无法被他人重复，有待进一步验证[40-41]；有研究将黄龙病菌与有益及有害的伴生菌在培养基内进行共培养，并发现黄龙病菌的增殖量高达50 倍，实现了黄龙病菌与伴生菌的共培养，有望推动病原学及生物学的基础研究[42]。4）病原分泌蛋白：黄龙病菌亚洲种Psy62基因组共有57个可能的Sec依赖分泌蛋白（HLB侵染过程中重要的毒力因子），其中分泌蛋白m3875和m4405具有抑制寄主PCD的功能，并且能影响寄主正常生长[43]；CLas Sec6为韧皮部杆菌属亚洲种特异性分泌蛋白，可作为黄龙病感病指示分子标志物[44]；分泌蛋白Clsp33不具有跨膜结构域，但具有典型的信号肽，长度为20 aa，具有分泌能力，对本氏烟具有致病性，可推测其为潜在的毒力因子[45]。5）寄主抗性评价：CLas 侵染柑橘寄主后，会引起大多数寄主防御相关蛋白或转录因子的上调表达，如过氧化氢酶、Cu/Zn 超氧化物歧化酶、几丁质酶、植物凝集素相关蛋白及神秘果素样蛋白等[46]；在黄龙病菌与柑橘互作早期，寄主叶脉和根分别调控糖代谢和次生代谢相关通路以响应CLas 侵染，而CLas通过调控物质跨膜运输和能量代谢来维持病原细胞在柑橘中的增殖和扩散[47]；SA（水杨酸）与MeSA（水杨酸甲酯）信号转导的关键酶基因CsSABP2-1 和CsSABP2-4 在柑橘SAR 响应CLas 侵染中起着重要作用，其高水平表达与柑橘HLB 抗性紧密相关[48]；染HLB的椪柑，萜类化合物中相对含量显著增加的有大根香叶烯D 和大根香叶烯B（柑橘类植物次生化合物中半萜及倍半萜含量与病原真菌的抑制效果呈正相关）[49]。6）基因：目前针对黄龙病菌序列拼接策略更多的是结合从头拼接和基于参考基因组的拼接方法进行互补，从而得到最终的基因组序列；黄龙病菌基因组由保守的染色体区域序列和高变异的原噬菌体序列组成；原噬菌体区域的变异主要表现为噬菌体类型的差异，其基因组大小约为1.26 Mb，GC含量约为36.5%；黄龙病菌缺乏编码毒素或特殊分泌系统的基因，含有一套完整的三羧酸循环（TCA）所需的酶，但是缺乏用于直接形成丙酮酸的酶，如丝氨酸脱水酶、丙氨酸消旋酶和丙氨酸脱氢酶[13]；黄龙病菌涉及DNA 复制和细胞分裂功能的管家基因表达较稳定，在CLas 的基因表达研究中可选择ftsZ+gyrA的基因组合作为内参基因[50]。
2.3.2 英文文献研究热点 对从WOS 获得的数据进行关键词（keyword）分析，生成关键词共现图谱。根据图谱截取频次大于100 的高频关键词信息，再选择LLR（Log-likelihood Ratio）算法，对关键词进行聚类，形成11 个有效聚类标签，最后将聚类结果可视化展示，如图6（右）。
11个聚类标签有：Asian citrus psyllid（#0亚洲柑橘木虱）、Penicillium digitatum（#1 柑橘绿霉病）、greening disease（#2 青果病）、gene expression（#3 基因表达）、fruit yield（#4 果实产量）、cardiovascular disease（#5心血管疾病）、rhabdovirus（#6棒状病毒）、asian citrus leafminer（#7 亚洲柑橘潜叶蛾）、campestris（#8 野生的）、pectin（#12 果胶）、essence（#14 本质）。根据关键词聚类图，进一步剔除与黄龙病无关的关键词，再将英文文献的黄龙病研究热点归纳为以下3个方面：
（1）提高柑橘生产力、防治药物的相关研究：1）黄龙病流行的情况下，为提高柑橘生产力，近年国际果园管理成果有：评估微量元素的最佳用量，如在佛罗里达，受HLB 影响的的幼树的最佳Mn 用量是8.9~11.5 kg·hm-2；改善灌溉系统：珍珠岩基质的土壤可节约用水；潜灌长凳比传统滴灌节省98%的水，且潜灌长凳所栽砧木的生长速度比滴灌快4 周；对不同类型的柑橘树精准施肥：受HLB 影响的柑橘树中，Mg 肥对土壤和养分浓度的影响比N 或Ca 的影响大；施用生物农药和化学农药[51-54]。2）药物方面，用赤霉素或抗氧化剂（尿酸、芸香苷）对受HLB影响的柑橘进行叶面喷雾，可减少韧皮部组织中的细胞死亡和过氧化氢浓度，并减轻HLB 症状[55]；噻唑磷（FOS）和铜铵复合物（CAC）组成根浸液，对染病植株处理90 d后，可有效控制HLB[56]；含有活性成分土霉素(OTC)的杀菌剂用于叶面喷雾，已用来控制美国佛罗里达州的HLB，其抑制植物中CLas种群的最低含量（w）为0.68 和0.86µg·g-1 [57]；除了药物，也有研究对染HLB 的柑橘树引入从健康柑橘树中分离的本地内生枯草芽孢杆菌L1-21，经过2 a 的时间，病树的CLas 发病率降低到不高于3%，因此有望利用本地内生菌重组柑橘内生微生物群，进而建立可持续的HLB控制策略[58]。
（2）柑橘木虱的相关研究：1）能穿越潜在的地理障碍（如道路和休耕地）；可在15~30 min 内从受感染的植物中获得病原体，并在8~12 d 的潜伏期后，在不到1 h内将病原体传播给健康的植物；具有显著的飞行能力：没有风的辅助下，3 h内分散320 m，最远2.4 km，有风的影响下，ACP 会顺风而分散，并随柑橘产区发生的高风速而移动；没有恶劣天气的影响下，12 d内ACP的传播路径至少2 km[59-61]；在-4 ℃的寒冷环境下，ACP可在两周内逐渐适应并在短时间内继续存活[62]。2）化学防治：其合成杀虫剂丙溴磷+氯氰菊酯对ACP 毒性更大，但杀虫剂不可持续且成本高，可探究物理刺激（植物挥发物、光、色）、破坏ACP 的生理行为（喂养和消化）及寄主植物对ACP 的抗性，来改进对ACP 的综合管理[63-64]。3）物理防治：用单个保护罩（IPC）可有效隔离木虱与柑橘幼树，IPC 引起的树冠内的微气候变化也促进植物生长，适合于HLB流行地区的新柑橘种植园；3D打印的黄色圆筒诱捕器的捕获率与黄色粘虫板接近，并且可重复利用和收集完好的ACP[65-67]。4）CLas与ACP的部分互作如下：CLas能在木虱体内持续存在12周，且木虱雌性产生的卵或后代未检测到该菌[68]；CLas 对ACP 的繁殖力（产卵、发育、交配）有着积极影响，可使成虫的饥饿程度更高，并使其更频繁地觅食和更倾向于长途飞行（可增加ACP的概率分布），以及降低对大多数商业杀虫剂的敏感性和提升对昆虫病原真菌的易感性；CLas阳性植物释放的水杨酸甲酯明显多于CLas 阴性植物，前者的枝条、成熟叶及着色对ACP更具有吸引力[4]。
（3）黄龙病原体的相关研究：1）离体培养：目前所有用CLas 实现无源生长和完成科赫法则的尝试都失败了，有研究尝试通过添加缺失的与可培养性相关的Lcr（Liberibacter crescens，新月自由杆菌）基因来实现CLas的复制无源生长，成功创造了初步的实验条件，为将大量“必要”的Lcr 基因转移到CLas提供了一种实用方法[69]；目前新月体乳杆菌菌株BT-1 在遗传上易受标准分子操作技术的控制，已被开发为一种替代模型，用于基因、调控元件、启动子和来源于未培养的致病性Liberibacters 的分泌效应子的功能研究[70]。2）病原分泌蛋白：CLas 基因组中，原噬菌体编码蛋白AGH17470 为非经典分泌蛋白，是第一个前噬菌体编码的分泌蛋白，能引发过敏反应（HR）并诱导强的植物免疫反应，可对本氏烟草进行瞬时表达，导致整个植物矮化[71]；CLas 的分泌蛋白SDE1 可用作检测标记，用于各种血清学平台以鉴定受感染的树木，优势有：a.监测不同类型的标记（即蛋白质对DNA）；b.潜在地增加了识别被感染的树木，尤其是在无症状阶段；c.允许支持大规模现场调查的成本可控的测定，有望替代qPCR 检测[72]。CLas的蛋白LasP235和效应子3参与HLB的发病机制为：a.两者的显著植物柑橘靶标包括柑橘先天免疫蛋白；b.能与多种柑橘蛋白质互作并抑制其功能，然后导致高水平的活性氧、杀菌脂质转移蛋白（LTP）的阻断和过早程序性细胞死亡（PCD）的诱导[73]。3）寄主抗性评价：SA（水杨酸）介导的SAR（植物获得性抗性）信号的实现需要活性SA的阈值水平，当SA水平升至某阈值以上时，SAR和其他防御反应被触发以防御病原体攻击，而HLB感染则通过干扰SA信号传导抑制柑橘免疫力[74]；寄主植物中与HLB 相关的潜在脂肪酸标志物：POA、OA、ALA和ARA，可见CLas 感染可能导致长链脂肪酸代谢的改变，也可能导致宿主对脂肪酸防御的操纵[75]。4）基因：遗传工程技术，如遗传转化和基因组编辑，是开发抗病作物的有效方法，目前有广谱抗病基因AtNPR1（一种修饰的植物硫素基因）和抗菌肽基因Cecropin B 和attacin A 已分别引入柑橘，均有效提高了植株对HLB 的抗性；近年来，基于簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的系统使基因组编辑成为一种不可或缺的遗传操作工具，已应用于包括柑橘在内的许多作物；在木虱的基因编辑方面也有创新突破，如BAPC辅助的CRISPR/Cas9系统，能够在成年雌性卵巢附近注射，并产生可遗传的种系基因编辑，不仅绕过了卵子显微注射的需要，也能抑制ACP的内共生体和Liberibacter病原体，不过仍面临着监管审批时间长和成本高的问题[76]；有研究已成功实现纳米粒子介导的体外被动给药和体内被动给药，有着高效低毒被动给药的潜力，其原理为：纳米颗粒可用作载体系统，将质粒DNA、RNA 和寡核苷酸等遗传物质高效、快速地传递到细胞中，从而减少当前农杆菌介导的转基因传递系统的缺点和限制[77]。
2.4 研究前沿
关键词突现是指在某一时期内与研究主题相关的词的频次显著增加，它能够挖掘研究热点，反映研究趋势[78]。与关键词分析相比，突现词分析可以捕捉到研究领域拐点和热点的出现时段，从而推断该领域的研究前沿。
2.4.1 中文文献研究前沿 笔者在本文中基于关键词（keyword）分析的基础，对黄龙病领域的突现词进行探测，得到突变强度最高的25 个关键词，如图7（左）所示。图中突现词列表按照起始年份的先后顺序进行排序，“Strength”表示关键词的突变强度，值越大表示突变强度越强，红色部分表示该突现词持续的时间长度，其起止年份分别与“Begin”和“End”列下的年份相对应。
图7 国内（左）与国际（右）柑橘黄龙病研究突现词
Fig. 7 Emergent words in domestic (left) and international (right) research on citrus Huanglongbing
图7（左）反映出中文文献的黄龙病研究领域于1956—2021 年间的研究趋势及研究前沿。根据该图可划分为3个时间段：1956—1978年、1979—2001年、2002—2021年，剔除与黄龙病无关的突现词，然后进行如下具体分析：
1956—1978 年，涌现出“黄梢病”（黄龙病的旧称）、“柑橘树”、“林孔湘”、“病毒病”、“病原体”、“类菌原体”等突现词，其中“病毒病”的突现强度最高，持续时间最长，表明这一阶段内，以林孔湘为主力的研究人员就黄龙病的致病原因展开了大量研究。黄龙病的致病因子在1956年首次被证明为病毒，在未更正为韧皮部杆菌之前得到学界的广泛认可。林孔湘尝试用湿热空气处理柑橘芽条，发现能短时间内有效破坏黄龙病的致病力且不损伤柑橘芽条的生活力，表明柑橘芽条的致死温度与黄龙病菌受破坏的温度有明显差距，为热治疗奠定了基础。1964 年，广西柳州园艺场的病树分布并非向原来病树区的四周扩散，而是沿边缘线扩展，病害田间发病中心不明显，是最早确认黄龙病害在田间存在着边界效应的事例[7]。1974—1975年，赵学源等[79]用四环素浸泡染病柑橘芽条2 h，然后将其嫁接在健康的柑橘树上，并发现柑橘树在未来5 年都没有发病，并首次确定出黄龙病原体对抗生素敏感的事实。
1979—2001 年，“柑橘生产”的突现强度最高，持续时间最长。说明在这一阶段，由于改革开放及进入WTO（世界贸易组织）后，在水果消费市场的冲击及黄龙病的影响下，我国开始重视柑橘的生产及布局优化工作，如扩大出口、根据适宜的生态区发展名特优新品种、建立规模化柑橘生产基地、提高果农福利、柑橘产业化及建立市场营销策略等[80]。这一时期，柑橘木虱的栖息地逐渐北移，其防治及预警势在必行，并总结出防控措施：控制人为传播（如引种）、及时挖除病树及药剂防治、通过种植适合天敌的栖息地进行生物防治[81]，在争取提高柑橘产量的同时做好防护工作。
2002—2021 年，“栽培技术”突现强度最高，持续时间最长，证明近年来，我国就柑橘的栽培技术持续展开研究，如栽培生草（百喜草、白三叶）来提高果实产量及提高土壤矿质养分（氮、钾、铁和锌等）含量[82-83]，以及广西的姑婆山野生元橘等16 种野生柑橘种质资源表现出更强的耐病性，可尝试用于培育抗病品种[84]。“防控”“综合防控”持续时间分别从2009—2017年、2015—2019年，持续时间较长，足以看出我国持续重视黄龙病的防控。这一期间，我国制定了HLB 的诊断标准、防控规范、发放救灾基金和设立国家重点研究项目等。2015—2019年，中国农业（农村）部安排近4亿元农业生产救灾资金用于支持防控黄龙病[85]。2017 年，“国家柑橘优势带HLB 综合防控协同创新联盟”成立，加强全国协同联动[2]。2019 年，广西壮族自治区人大常委会通过了《广西壮族自治区柑橘黄龙病防控规定》，这是我国首部黄龙病防控地方性法规[86]。相信黄龙病的防控工作以及柑橘优质品种的培育仍将是研究的主要趋势。
2.4.2 英文文献研究前沿 在关键词（keyword）分析的基础上，笔者对该领域的突现词进行探测，得到突变强度较高的25 个关键词，如图7（右）所示。该图反映出英文文献的黄龙病研究领域在2002—2021 年间的研究趋势及前沿。将年段细分为2002—2004 年、2005—2011 年、2012—2021 年3 个时间段，剔除与黄龙病无关的突现词，然后分别探讨各个阶段的研究状况。
2002—2004 年间，该阶段出现了“strain（菌株）”，可见当时研究前沿侧重于对病菌的探索。此时多数研究已采用聚合酶链式反应（PCR）快速且灵敏的检测方法，其中的实时荧光PCR（RT-PCR，也叫定量PCR（qPCR））自1996年开始商用以来，已成为迄今为止用于检测和定量HLB 病原体最准确和最灵敏的方法[87]。在PCR 检测技术的应用下，巴西作为仅次于中国的柑橘生产大国，于2004年首次报告由CLas 引起的HLB[88]。HLB 在亚非拉地区也相继被发现，但只有成本高昂且耗时长的PCR技术可以确认病原体的存在，为了及早控制病情，最好通过综合疾病管理来管控，包括使用健康的苗圃材料、清除受感染的树木或树枝以及综合病媒控制，同时在无HLB 的柑橘产区做好消杀传播媒介的预警工作[89]。
2005—2011年间，“DNA（脱氧核糖核酸）”的持续时间最长，“PCR（聚合酶链式反应）”的突现强度最大，表明在该阶段，分子生物学为研究前沿。美国于2005 年9 月在佛罗里达州首次发现到由黄龙病菌亚洲种CLas 引起的HLB[61]。CLas 的全基因序列通过测序及PCR等多种手段被获取并注释[90]。利用PCR 也可确定病原体在寄主中的分布，如：柑橘木虱的唾液腺是CLas 的重要传播屏障，以及CLas可能在木虱的消化道和唾液腺中复制或积累[91]；CLas 分布在柑橘树的树皮组织、叶中脉、根部以及不同的花果部分，但不存在于胚乳和胚芽中，分布也不均匀，可从感染部位传播到植物全身的不同部位[92]。此外，CLas可影响寄主植物中的基因表达变化，包括细胞防御、运输、细胞组织、光合作用和碳水化合物代谢等，尤其可诱导韧皮部中特异性凝集素PP2 样蛋白的转录物积累[93]。足以看出在此阶段，黄龙病的分子研究领域正处在蓬勃发展中。
2012—2021 年间，突现词有“classification（分类）”、“hemiptera psyllidae（半翅目木虱科）”、“trioza erytreae（非洲柑橘木虱）”、“performance（性能）”，持续时间都较短，其中“hemiptera psyllidae（半翅目木虱科）”突现强度最大，可看出此时国际研究开始关注非洲柑橘木虱（简称AfCP）。AfCP在欧洲持续蔓延，对欧洲的柑橘产业造成潜在风险，目前有研究者主张对未检测到HLB的地方实行生物防治，对检测到HLB 的地方进行严格的化学防治[94]。黄龙病的分类检测技术也在不断创新，具体为：（1）使用环介导等温扩增：简称LAMP，可在单一温度下进行特异性扩增DNA 模板，比传统PCR 需要更少的专业设备；（2）LAMP 侧向流动试纸：具有qPCR 的功效，并且经济、方便、响应迅速，尚未商用；（3）重组酶聚合酶扩增：简称RPA，使用对象为粗提物和便携式加热块，可在大约30 min 内完成整个测试过程，灵敏度与qPCR 相当，但距离替代qPCR 还需长期的验证；（4）基于生物标志物和植物挥发物（病原体分泌物）和感染宿主释放的挥发性有机化合物（VOC））的气相色谱-质谱(GC-MS)、气相色谱/差示迁移谱或者犬科动物进行HLB 识别检测的技术[87]；（5）解吸电喷雾电离与质谱成像：简称DESI-MSI，可快速、有效地检测甜橙中的生物标志物，有望开发成实时、快速的诊断技术[95]；（6）高光谱遥感设备：将高光谱相机安装于无人机，基于像素级识别HLB，分类准确率不低于99%，有望用于柑橘病害的早期无损检测和分级[96]。
3 结论与展望
3.1 结论
笔者在本文中基于知识图谱技术，通过检索CNKI、Web of Science数据库，收集与黄龙病研究相关的文献，再采用CiteSpace软件构建知识图谱并进行可视化分析，可总结出4 条结论：（1）国内外正加强对黄龙病的研究，预计未来仍会保持热度；（2）美国的发文量全球最多，国际影响力最强。我国机构虽已成为国际黄龙病研究领域的重要力量，但其科研实力与美国相比，仍存在巨大差距；（3）中文文献的研究热点主要包括黄龙病综合防治和黄龙病病原体，英文文献的研究热点聚焦于提高柑橘生产力、防治药物、柑橘木虱和黄龙病病原体方面等；（4）中文文献近年关注优势品种的栽培技术以及持续重视综合防控，英文文献近年则关注柑橘木虱的生理生化特性及防治手段，开始重视非洲柑橘木虱对欧洲黄龙病的潜在威胁，并对黄龙病的分类检测技术进行不断创新。
进一步讨论，美国的主体研究形式是小单元开展，发表文章时甚至有国际合作人员（大多为海外进修人员）。我国通常以大合作为主，只是考虑到知识产权的归属问题，成果大多为分开发表的形式，攻关起始时间也比美国早几十年。正常来说，我国在黄龙病领域的影响力应高于美国，但根据图谱分析，我国在黄龙病的科研影响力远低于美国。究其原因，除了历史因素外，主要与经费限制有关。我国黄龙病的研究经费远低于美国的研发投入[97]，美国自2005年发现该病后，所投入的研究经费是中国的40余倍，因此客观上我国黄龙病科研综合实力不如美国。
本文也存在不足之处，在于：（1）选用的WOS数据库的收录年限只有2002—2021年，原因是所属机构所订购的WOS数据库只收录进20 a的文献，故无法系统分析发表时间更早的文献数据；（2）部分英文作者有很大可能性来自同一国家，尤其是我国，因此我国与国际的热点与前沿部分有难以避免的交叉重合之处，同时也存在着导致小部分数据漏检的问题：我国部分作者发表基于其他语种的文献及使用不同英文名字写法发表英文文章，种种因素致使本次研究无法完美地统计数据，也难以详细区分出我国与国际一流水平的科研差异，只能通过中英文发文量及研究主体对我国相关研究进行计量分析，并得出“我国黄龙病的综合科研实力落后于美国”的初步结论。
3.2 展望
为了缩小我国与美国的黄龙病的科研差距，除了政府持续投入大量资金及进一步完善防控法规外，还需科研机构牵头建立线上沟通平台，以便即时答疑，同时也要定期举行全国性的会议，以便确定各大机构接下来的具体攻关方向和更为细致的分工合作，从而更加从容地应对黄龙病广且深的攻关难题。此外，由于黄龙病菌暂时无法进行离体培养，科研人员难以从形态学、生物学、病原学等方面对病原体进行深入研究[3]，应需坚持寻找黄龙病菌离体培养的技术，或者另寻其他可替代的方式。
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