国际植物新品种保护联盟是根据《国际植物新品种保护公约(International Convention for the Protection of New Varieties of Plants,UPOVC)》建立的政府间组织,其总部设在瑞士日内瓦。该组织的法语名称为“Union Internantionale pour la Protection des Otentions Végétales”,简称“UPOV”。UPOV 的使命是建立一个有效的国际植物新品种权保护体系,协调和促进成员国之间在行政和技术领域的合作,目的是鼓励植物新品种的培育,造福社会。UPOVC 于1961 年12 月2 日在法国巴黎通过,1968年8月10日由英国、荷兰和德国批准正式生效,并先后于1972 年11 月10 日、1978 年10 月23 日和1991年3 月19 日进行了文本修订(https://upovlex.upov.int/en/convention)。1991 文本的生效给育种者带来了更强大的法律保护,1978文本成为了植物新品种保护联盟成员国现行法律的最低标准。1999年4月23日,中国正式加入UPOV,成为其第39个成员国,执行UPOV 1978文本,开始实施植物新品种保护制度,并研制颁布相应的DUS 测试指南[1]。UPOV 1978 文本对植物新品种的保护力度低于UPOV 大部分成员国采用的UPOV 1991文本,随着中国植物新品种培育水平的提高和对植物新品种知识产权更全面的保护需要,2021年12月24日,第十三届全国人民代表大会常务委员会第三十二次会议通过了《全国人民代表大会常务委员会关于修改〈中华人民共和国种子法〉的决定》,新种子法于2022 年3 月1日起施行。中国将成为UPOV 成员国中第69 个实行实质性派生品种制度的国家。
植物新品种测试是通过田间种植试验或其他试验,对申请保护的新品种特异性(distinctness)、一致性(uniformity)和稳定性(stability)进行评价的过程,简称DUS 测试[2]。在中国DUS 测试鉴定标准和方法需要参照UPOV植物新品种鉴定标准、《中华人民共和国植物新品种保护条例》《中华人民共和国植物新品种保护条例实施细则(农业部分)》以及《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》(GB/T 19557.1—2004)[3]。DUS 测试指南是对测试品种开展DUS测试的技术依据和标准,是判定测试品种是否为新品种、能否授予新品种权的重要依据[4]。截止到2022 年4 月,UPOV 已发布337 份DUS 测试指南(https://www.upov.int/test_guidelines/en/),中国现行测试指南有305 份(http://openstd.samr.gov.cn/bzgk/gb/index),对指导植物新品种的鉴定、规范描述方法具有重要作用[5-6]。
无花果(Ficus carica L.)是桑科(Moraceae)榕属(Ficus L.)植物。据报道榕属植物种类有600~1900 种,只有少数种的果实可以食用[7]。无花果的栽培历史超过1 万年,是最早被人类驯化的果树之一[8-9]。中国种植无花果的历史超过1000年,近年来栽培面积扩大很快,主要产地分布在山东、新疆、四川及江苏等省份[10]。中国的无花果种植品种也日益丰富,目前种植的主要品种包括青皮、布兰瑞克、波姬红、玛斯义陶芬、新疆黄无花果等。新品种的自主培育和国外新品种的引进,对无花果的DUS测试和植物新品种权的申请与保护提出了新的要求。
现行的无花果DUS 测试指南极大地推进和规范了中国无花果新品种的申请与保护工作,笔者在实践工作中也发现一些需要调整和完善的内容。笔者在本文中对UPOV 和中国的无花果品种DUS 测试指南进行比较分析,总结二者的异同和优缺点,为修订中国无花果品种DUS测试指南提供参考思路,进而加强中国对无花果新品种的保护。
中国现行的无花果品种测试指南为农业行业标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南无 花 果》(NY/T 2587—2014),以 下 简 称NY/T 2587[11],该标准于2014年3月24日发布,2014年6月1日实施。UPOV于2010年3月24日发布并实施了无花果品种DUS测试指南,版本号为TG/265/1[12]。
2个指南均要求以扦插苗形式提供,不经过任何会影响品种性状表达的处理,如果已处理,需提供处理的详细说明,并且提交的繁殖材料应符合植物检疫的相关规定。2个指南对提交材料的质量要求近似,TG/265/1 要求提供的繁殖材料健康、活力好及无病虫害,NY/T 2587对提交的繁殖材料质量要求更为详细:苗为1 年生,高度60 cm 以上,新生茎主干基部5 cm 处茎粗度(直径)0.8 cm 以上,芽眼健壮饱满;根数6 条以上,根基部粗度0.2 cm 以上。2 个指南对提交的繁殖材料苗木数量要求不同。NY/T 2587要求苗木不少于12株,TG/265/1要求不少于5株。
无花果品种DUS测试指南的测试方法主要对测试周期、测试地点、试验设计及测试数量等做了具体要求。2个指南对测试周期要求相同,均至少为2个独立的生长周期。无花果的1个独立生长周期指的是从萌芽开始,经过正常结果到休眠期结束的整个生长季节。由于现代栽培技术的发展,无花果被引入三亚、西双版纳等热带地区进行种植,并在温带地区通过设施栽培实现长采果期和反季节生产[13]。在无冬季低温的条件下,无花果没有休眠期,也不集中落叶,针对无休眠期的实际栽培情况,生长周期为从萌芽开始,经过正常结果至下一次萌芽的整个生长季节。对测试地点的要求也相同,均规定测试通常在1个地点进行,如果某些性状在该地点不能充分表达,可在其他符合条件的地点对其进行观测。TG/265/1还对在多个地点进行测试的情况,指出要根据TGP/9 文件(特异性审查)[14]提供的指导进行观测。
2 个指南在试验设计和测试数量方面要求不同。试验设计方面,NY/T 2587要求申请品种和近似品种相邻种植,每个品种种植不少于10株,株距2~3 m,行距3~5 m,田间管理可按当地果园生产园管理方式进行。TG/265/1要求每个测试品种种植不少于5株,种植条件适合完成整个年度的正常测试工作。测试数量方面,NY/T 2587对观测性状进行了个体和群体的区分,包括个体测量(MS)、个体目测(VS)、群体测量(MG)、群体目测(VG)。除非另有说明,个体观测性状(VS、MS)植株取样数量不少于10株,在观测植株的器官或部位时,每个植株取样数量应为1个。群体观测性状(VG、MG)应观测整个小区或规定大小的混合样本。TG/265/1要求所有的观察植株取样数量为5株或取5株植物的部分进行观察,在观测植株的器官或部位时,每个植株取样数量应为2个。
2 个指南对特异性判定的标准基本一致,申请品种应明显区别于所有已知品种。在测试中,当申请品种至少在1个性状上与近似品种具有明显且恒定的差异时,即可判定申请品种具备特异性。(1)差异恒定:要保证在种植试验中所观察到的性状差异是恒定的,应至少在2 个独立的生长周期中测试这一性状。如果不同品种之间观察到的差异非常明显,或者材料种植的环境始终一致,受环境影响较小的性状,就没有必要观察2 个生长周期。(2)差异明显:判断2 个品种之间的差异是否明显取决于许多因素,尤其要考虑被测试性状的表达类型,即是否是质量性状、数量性状或假质量性状。
对于一致性的评估,2 个指南均采用1%的群体标准和至少95%的接受概率,但TG/265/1 要求在样本量为5 株的情况下,不允许有异型株的存在,NY/T 2587 则要求样本量为10 株时,最多允许有1 株异型株。2个指南对稳定性的判定相同,如果1个品种具备一致性,则可认为该品种具备稳定性,一般不对稳定性进行测试。必要时,可以种植该品种的下一批苗木,与以前提供的繁殖材料相比,若性状表达无明显变化,则可判定该品种具备稳定性。
性状是指能准确识别、区分和描述的可遗传表达的植物特征或特性[1]。
2.4.1 性状的功能分类及数量 NY/T 2587 和TG/265/1的测试性状按照功能和要求分为5类:包括基本性状、带星号(*)性状、分组性状、选测性状和技术问卷性状(表1)。
表1 无花果品种DUS 测试指南性状的功能分类及数量
Table 1 Functional classification and number of characteristics in different DUS test guidelines for Ficus carica L.
注:“-”表示无该性状分类。
Note:“-”indicates no classification of characteristics.
测试指南Test guidelines TG/265/1 NY/T 2587基本性状Standard test guidelines characteristics 78 63带星号性状Asterisked characteristics 56-分组性状Grouping characteristics选测性状Additional characteristics技术问卷性状Technical questionnaire characteristics 65-5 69
基本性状是指DUS 测试中UPOV 接受的性状以及UPOV成员能够从中选择适合于特定环境的性状[15]。TG/265/1 基本性状有78 个,而NY/T 2587 基本性状有63个。
带星号(*)性状是UPOV成员测试时,进行品种描述必须采纳的性状,对于统一品种描述十分重要,除非受环境条件限制性状的表达状态无法测试,否则所有UPOV成员都应使用这些性状。TG/265/1带星号性状有56 个,占基本性状的71.79%,而NY/T 2587无带星号性状。
分组性状作为筛选近似品种的依据,在特异性测试种植试验中将不相关的已知品种排除在外,将相似品种种在一起。质量性状是最好的分组性状,在TG/265/1测试指南中分组性状既是带星号(*)性状又是技术问卷中的性状。当选择数量性状或假质量性状作为分组性状时,应考虑选用的性状数据即使来自不同的地点,也能够有效区分已知品种。在TG/265/1中有6个分组性状,而在NY/T 2587中有5个分组性状。TG/265/1 比NY/T 2587 多了1 个质量性状,即无花果的品种类型。在TG/265/1测试指南中根据授粉需求和结果特性将无花果分为5类,分别为Unífera、Bífera、Smyrna(斯密尔那型)、San Pedro(中间型)和Caprifig(野生型)。其中Unífera和Bífera为普通型无花果,Unífera指的是仅产生单性结实的无花果,Bífera 指的是两熟单性结实无花果。NY/T 2587 测试指南将品种类型在附录C,无花果技术问卷中未对普通型无花果进行细分,而是在结果习性(性状56)中将其分为春、夏、秋果。对于选测性状,NY/T 2587列出5个,分别是果实的香味、果肉质地、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、果肉汁液这5个果实性状,而TG/265/1则无相关说明。技术问卷性状在TG/265/1中有6个,而在NY/T 2587中列出9个。
2.4.2 性状的内容分类、数量和观测时期 对2个测试指南的性状进行综合分析,可将测试性状归纳为树体性状、1年生枝性状、2年生枝性状、顶芽性状、叶性状及果实性状6类。TG/265/1和NY/T 2587测试指南这6类性状的数量和观测时期均有不同(表2)。TG/265/1 对果实性状的观测不仅观察1 年生枝上生产的果实,也要观察新梢上生产的无花果,2个指南果实性状居多,分别占所有测试性状的68.0%和52.4%。
表2 无花果品种DUS 测试指南性状的内容分类、数量和测试信息差异
Table 2 Content classification,number and test information of characteristics in two DUS test guidelines for Ficus carica L.
注:相同点未列出;“/”表示无性状解释说明。下同。
Note:Similarities are not listed.“/”indicates no explanatory note for the characteristics.The same below.
性状分类Classification of characteristics树体性状Plant characteristics枝条性状Shoot characteristics性状数量Number of characteristics TG/265/1 NY/T 2587NY/T 2587/顶芽性状Terminal bud characteristics叶性状Leaf characteristics 7 6 4 8 5 8 4观测枝条中部节间长目测粗度Length of internodes: Observe the middle part of shoots.Visual thickness/果实性状Fruit characteristics测试信息Test information TG/265/1通过树干周长评估树势Vigor is assessed as trunk circumference观测枝条中部1/3的节间数Number of internodes:Observe the middle one third of shoots休眠期观察顶芽颜色Observe the color during dormancy夏季观测新梢中部叶片Observe leaves in the middle of shoots in summer观测第一季果和主收果Observe first and main crop优先观测主要裂叶类型叶片,其次新梢中部叶片Observe predominant type of leaves in priority,then leaves in the middle of shoots观测第一季果Observe main crop 13 53 33
2.4.3 单个性状差异分析 TG/265/1 和NY/T 2587测试性状完全相同的性状有23 个。NY/T 2587 与TG/265/1 测试指南相比增加了“结果习性、皮孔形状、皮孔大小、皮孔数量、1年生枝:粗度、幼叶:绿色程度、裂片:二次裂刻、叶片:宽度、叶片:绿色程度、叶片:背面茸毛、叶柄:长度、叶柄:颜色、果实:果粉、果柄:粗度、果柄:颜色、果实:果脉密度、果实:果点明显度、果实:香味、果实:果肉质地、果实:可溶性固形物含量、果实:可滴定酸含量”21 个性状,删除了“品种类型、结瘤、在叶柄两侧叶片基部的裂片的多少、根出条数量、2 年生枝形态、2 年生枝叶片数量、果实大小、果孔周围裂口有无、果皮的抗损性”9 个性状,对“分枝数、顶芽大小、顶芽萌动期、顶部裂片长与叶长的比率、叶片:长度、单株果实数量、果实:横径、果实:纵径、果实:质量、果柄:长度、果实:颈长度、果实:空腔大小”进行了分级代码的调整,对结瘤、顶芽等性状进行了表达状态和分级代码的调整,还将“有无叶柄两侧叶片基部的裂片”和“叶片:裂刻类型”这一性状进行整合,加了“七裂”这一表达状态(表3)。NY/T 2587测试指南通过整合,增加部分性状,使得叶片观测和果实观测更为详细,增强了无花果测试指南的可操作性。
表3 TG/265/1 和NY/T 2587 测试指南性状差异
Table 3 Differences between TG/265/1 and NY/T 2587 test guidelines
注:A/P.无/有;S/M/L.小/中/大;LT/T/ST.长三角/三角形/短三角;GB.灰褐色;W/M/S.弱/中/强;SE.七裂;MC/SC/C.轻微距状/严重距状/距状;R.红色。“/”表示无此项描述。
Note:A/P.Absent/present; S/M/L.Small/medium/large; LT/T/ST.Long triangle/triangle/short triangle; GB.Grey brown; W/M/S.Weak/medium/strong;SE.Seven-lobed;MC/SC/C.Moderately calcarate/strongly calcarate/calcarate;R.Red.“/”indicates there is no description.
序号No.性状编号Number of characteristics TG/265/1分级数Grade TG/265/1 NY/T 2587/性状名称Characteristics name TG/265/1结瘤Bark tubers结瘤数量Number of bark tubers顶芽长宽比Terminal bud:length/width ratio顶芽颜色Terminal bud:color两年生枝:潜伏芽隆起程度Two-year-old shoot:bud support swellings叶片:主要裂刻类型Leaf:predominant type叶柄两侧叶片基部的裂片Lobed leaf:basal lateral lobes on petiole sinus叶柄两侧叶片基部的裂片数量Lobed leaf:size of basal lateral lobes on petiole sinus叶片:基部形状Leaf:shape of leaf base果实:果皮底色Fruit:ground color of skin果实:裂皮性Fruit:cracking of skin(main crop)NY/T 2587/NY/T 2587 1 2 3 4 5 6 7 8 9 6 7 1 1表达状态描述差异State differences TG/265/1无、有A/P NY/T 2587/5 13结瘤数量Number of bark tubers顶芽形状Terminal bud shape小、中、大S/M/L 13 14长三角、三角形、短三角LT/T/ST/14 16灰褐色GB无、小、中、大A/S/M/L弱、中、强W/M/S 17 19顶芽颜色Terminal bud:color两年生枝:潜伏芽隆起程度Two-year-old shoot:bud support swellings叶片:裂刻类型Leaf:predominant type/七裂SE 23无、有A/P 24//少、中、多S/M/L 21//24轻微距状、严重距状MC/SC// 距状10 35 42 Ca红色R 11 67 50叶片:基部形状Leaf:shape of leaf base果实:果皮底色Fruit:ground color of skin果实:裂果性Fruit:cracking of fruit 9 7 7 4 7 5 9 7 5 7 3/3 3 3 3 7 / / 4 8 3//
性状表除了列出性状名称、表达状态及代码,还列出了相对应的标准品种,以便于确定相关性状的不同表达状态、校正环境因素引起的差异、统一品种描述。TG/265/1 所有性状都有标准品种作参照,标准品种多达85 个,而NY/T 2587 仅有20 个标准品种,大多数性状并未提供标准品种作为参照。
DUS测试是品种登记、品种权申请等工作中必不可少的重要环节,而DUS 测试指南是开展DUS测试的重要依据。中国无花果品种DUS 测试指南(NY/T 2587)是参考UPOV无花果品种DUS测试指南(TG/265/1)自主研制而成,于2014 年颁布实施。2 个指南在测试周期、测试地点和测试时期差别不大,差异主要表现在对繁殖材料的要求、试验设计、测试数量和测试性状等方面。在繁殖材料要求、试验设计方面,NY/T 2587 测试指南增加了苗木提交的数量和种植数量,并提出了具体的质量要求和种植要求;在测试数量方面,NY/T 2587测试指南将观测性状进行个体和群体之分,并对观测数量提出具体要求。在测试性状方面,TG/265/1 指南在果实性状方面考虑到无花果可能存在2个主要采收季的特性,对果实性状不仅观测1 年生枝上成熟的果(first crop),也要对新梢上生产的无花果(main crop)进行观测,TG/265/1 指南有53 个果实性状,其中first crop 和main crop 果实性状各占26 个。在叶片性状和1年生枝性状方面,NY/T 2587删除或新增了部分性状,并对部分性状的表达状态和分级代码进行了调整,使得叶片观测和枝条观测更为详细。
笔者在无花果的DUS测试实践中,也发现了一些问题,通过与TG/265/1测试指南的对比,并结合实际经验,对NY/T 2587 测试指南提出以下修订建议,以期提升中国测试指南实际指导能力和适用性(表4)。
表4 NY/T 2587 修订建议
Table 4 NY/T 2587 revision suggestions
序号No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 NY/T 2587修改意见Revision suggestions of NY/T 2587“顶芽形状”参照TG/265/1修改Modify“Terminal bud shape”as TG/265/1增加“果孔周围裂口有无”性状Add characteristic:“Fruit:Cracking around ostiolo”“果实裂果性”修改为“果实裂皮性”Revise“Fruit:Cracking of fruits”to“Fruit:Cracking of skin”修改理由Reasons for revision长宽比比顶芽形状描述更准确。Length/width ratio is more accurate than shape description.不同品种该性状存在差异。Varieties differ in this characteristic.此性状的图例指的是无花果果皮裂痕。The figure demonstration of this character is fruit skin cracking other than cracking of fruits.国内使用嫁接繁殖。Grafting materials are used in China.该性状具有良好的品种区分性。It is a strong character differentiate varieties.无花果的品种类型是重要性状。Production type of figs is an important characteristic.以季节描述无花果果实成熟期不恰当。主收果构成主要产量,应是果实特征测试主要内容。It’s inappropriate to define fig fruits by season.The first crop characteristics should be included in additional test, they are different from the main crop.各性状都应有易查询的标准品种。There should be standard varieties for each character.减少人为误差。To reduce human errors in testing.10在热带地区以及部分温带地区的设施栽培时,无花果不休眠。Fig trees do not dormant in warm conditions.11 12 13接受嫁接和插条繁殖材料Accept grafting materials and cuttings增加性状“两年生枝下垂与否”Add“plant:Weeping of secondary shoots”将“品种类型”纳入测试性状Add“Production type”用第一季果(first crop)和主收果(main crop)替代春、夏、秋果的描述,并选测第一季果First crop and main crop should be used to replace the descriptions of spring,summer and autumn fruit,fruit characteristics of the first crop should be included in additional test补充和引进标准品种Introduce more standard varieties定义性状观测方法,设定性状分级范围标准Define characteristics observation method.Set characteristics grading range criteria重新定义生长周期:去除休眠要求,以365 d为1个测试周期Revise the definition of a growing cycle:delete the expression of dormancy,using 365 days as a test circle调整测试要求的株行距,株距建议缩减到最小1 m Revise the plant spacing requirement,decrease the minimum plant distance to 1 m附录B.2(c)修改为观测主收果第一批成熟果实Revise appendix B.2(c)to observe the first ripe fruits of main crop.附录C中C.3.4“原生型”改为“野生型”Revise appendix C.3.4“native”to“caprifig”2米的距离是以前的种植方式,现在更多的是采用高密度栽培。Distance of 2 m was the old way of growing, high density cultivation is more applied now.“第一次收获季成熟果实”有歧义。The phrase“first harvest of ripe fruit”is ambiguous.NY/T 2587翻译不准确。Inaccurate translation.
全世界有700 多个无花果品种,中国的无花果基本都引自国外,有120 多个品种[16]。与国外无花果种质资源和育种选种研究相比,中国的无花果研究起步较晚,广泛种植的无花果品种少,栽培品种类型单一,全部是普通型无花果。近年来,中国引进和自主选育的无花果品种均快速增加[17-19],也开展了雄树引进、雄树育种,以及尝试对中间型无花果进行应用的研究[20-22]。因此,测试指南修订建议将无花果“品种类型”纳入测试性状,而非仅将“品种类型”:普通型、斯密尔那型、中间型和野生型无花果放在“附录C:技术问卷”中。
标准品种能帮助确定相关性状的不同表达状态和校正环境因素引起的差异。TG/265/1中共279个性状,仅3 个未列标准品种,比例为1.075%;而NY/T 2587 中,共223 个性状,85 个未列标准品种,比例为38.117%。NY/T 2587中用于性状参照的标准品种比TG/265/1少65个,且大部分标准品种在国内少见种植或没有,这增加了无花果DUS测试的实际操作难度。针对这一情况,一方面,笔者建议未列标准品种作参照的性状可按TG/265/1所列,应尽量补齐各性状的标准品种,并从国外引进一些较为通用的品种,补充中国的无花果标准品种种植名录;另一方面,国内已经优选出一些优秀的无花果品种广为种植,如波姬红、新疆早黄、108B以及芭劳奈等,对这些无花果品种的性状进行准确描述,并列入标准品种,用于后续新品种的性状参照,有利于解决无花果DUS测试的标准品种问题,并形成有中国特色的标准品种群体。
在果实性状方面,由于无花果果实分批成熟的特性和较大跨度的采收季,在对无花果果实描述时,TG/265/1 中的主收果(main crop)和第一季果(first crop)比NY/T 2587 春果、夏果、秋果更准确。TG/265/1兼顾主收果和第一季果,是因为国外无花果类型丰富,而国内主要销售和食用的是主收果。由于国内的种植和修剪特征,第一季果很少,因此NY/T 2587 未要求观测第一季果。而第一季果和主收果的性状存在明显差异,因此建议将第一季果的果实性状增补为选测性状。果实可溶性固形物含量、可滴定酸含量以及果肉汁液等性状受气候环境和栽培条件的影响较大,同一品种在不同地域、年份和栽培条件下可能存在性状差异,但由于该类性状是果实品质的重要性状,对品种特征标识具有较重要作用,因此可继续保留为选测性状。
NY/T 2587 测试指南在2014 年制定,当时国内无花果品种少,对无花果认识和研究工作也非常有限,NY/T 2587 测试指南中的测试材料全部是普通型无花果,一些性状的表达状态是通过无花果品种描述、图鉴和专家推荐的标准品种而制定的[23],存在性状说明和分级不合理的问题,如1 年生枝粗度仅通过目测评价,有关长短、粗细、数量多少等具体内容均未提供评判标准,加上无标准品种参照,许多性状分级测试者仅能根据经验判定,不利于测试准确性和可比性的提高。
此外,随着现代分子生物学技术的发展,分子标记技术已经逐步应用于遗传多样性研究、遗传图谱构建、分子标记辅助育种和品种鉴定等方面,该技术操作简单快捷,稳定性好,多态性丰富。目前,中国利用简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)分子标记技术,在部分植物上已经制定并实施了品种鉴定的相关标准[24-27]。已有一些专家学者利用SSR标记方法开展了无花果种质遗传多样性和指纹图谱构建等方面的研究[28-30],但利用SSR分子标记进行无花果品种鉴定的相关标准还未制定。建议加快制定和补充无花果分子鉴定标准,作为对无花果DUS测试的补充。
综上所述,基于无花果产业发展和新品种权申请测试的需要,笔者开展了大量的DUS 测试工作,在实践中发现了现有指南的一些问题,进行了分析、思考,并将现行指南与UPOV的无花果DUS测试指南进行了对比,提出了对现行无花果测试指南的修订建议,以对中国无花果品种的选育、品质测试和品种保护等提供更有力的支持。
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Comparative analysis of test guidelines for distinctness, uniformity and stability of Fig(Ficus carica L.)formulated by China and UPOV