基于SSR标记的澳洲坚果种质资源DNA指纹图谱的构建

澳洲坚果（Macadamia spp.）是世界上重要的坚果作物之一，原产于澳大利亚东海岸亚热带雨林[1-3]。我国大陆地区于20 世纪70 年代末开始澳洲坚果引种试种，至2020 年末，中国澳洲坚果种植面积已占全世界的63%。种质资源的收集与保护及优良品种的选育是澳洲坚果产业持续发展的关键。目前国内澳洲坚果育种工作以国外引种和国内实生选种为主，随着育种工作的推进，新品种登记及审定数量不断增加。在生产中，同物异名或同名异物的现象已开始出现，危害育种者和生产者的权益。在澳洲坚果种质资源收集过程中，如何对其快速鉴定以避免重复收集及实现有效利用，是澳洲坚果种质资源收集及保护工作的重要内容。

利用分子标记构建DNA 指纹图谱广泛用于苹果[4-5]、柑橘[6]、杏[7]、核桃[8-9]等果树的品种保护及种质鉴定。澳洲坚果相关研究中，蔡元保等[10]建立SCoT标记反应体系并对12 份澳洲坚果种质扩增，通过3对引物组合将供试材料完全区分，构建了12份材料的指纹图谱。SSR 标记具有共显性，重复性好等优点，被国际植物新品种保护联盟（UPOV）推荐为构建DNA指纹数据库的分子标记之一[11]，亦是国内植物品种鉴定DNA 分子标记法推荐的方法之一[12]。将SSR标记应用于澳洲坚果DAN指纹图谱研究，在国内外尚未见报道。

笔者在本研究中基于已公布的基因组序列设计、筛选一套高多态性SSR 引物，通过毛细管电泳建立澳洲坚果部分种质的DNA指纹图谱，构建其分子身份证，以期为澳洲坚果新品种保护及种质资源快速分子鉴定提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料均取自农业部景洪澳洲坚果种质资源圃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每份材料从3个单株采集新鲜幼嫩叶片混合，采用CTAB法提取叶片基因组DNA。

1.2.2 SSR 引物 在NCBI 网站上搜索并下载澳洲坚果基因组序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=CM023674.1），利用Kmer-SSR 搜索重复碱基位点，然后编程处理序列，使用Primer3 批量设计引物。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol·L-1 dNTP 0.4 μL，正反引物各0.3 μL，DNA模板2 μL（20 ng·μL-1），5 U Taq 0.2 μL，ddH2O 14.8 μL。

PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃到50 ℃降落复性30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；最终72 ℃延伸3 min。

1.2.4 电泳检测 PCR 产物在2%琼脂糖凝胶电泳中检测，选取其中条带明亮单一、扩增效果好的进行后续PAGE 检测；将初步挑选出来的PCR 产物加入上样缓冲液，94 ℃变性10 min，于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h（恒定功率90 W），银染检测。从中挑选具有多态性且与预期扩增产物片段大小一致的引物；筛选后的SSR引物标记6-FAM荧光染料合成荧光引物，经PCR 扩增，取PCR 产物0.3 μL、分子质量内标0.5 μL和去离子甲酰胺9.5 μL混合加入PCR板，95 ℃变性5 min，4 ℃冷却后离心，使用3730XL测序仪进行毛细管电泳。

1.2.5 数据处理 利用Genemarker V2.2.0 软件对测序仪得到的原始数据进行分析，通过比较泳道内分子质量内标与样品峰值的位置，得到片段大小。统计各样品等位基因位点，纯合位点记录为X，杂合位点记录为X/Y，杂合位点中的小片段数据在前，大片段数据在后，等位变异缺失位点记录为0。参照杨文娟[13]和郭艳春等[14]的方法，将每对引物获得的全部等位基因进行数字+英文字母形式的编码，按分子质量从小到大的顺序用数字1～9 依次表示，超出9 的部分用英文字母A～Z 依次表示，构建供试材料的指纹图谱代码。通过在线条码生成器（http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode128b.php）和二维码生成器（https://cli.im/），分别生成条形码和二维码形式的DNA分子身份证。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

根据重复单元2 个碱基以上，重复次数8 次以上，在染色体上分布均匀的原则，从基因组中搜索设计的SSR引物中共挑选240对用于后续筛选。从供试样品中选取表型差异较大的4 份材料（J72、J99、HAES695、O.C）对240 对引物进行PCR 扩增，PCR产物经2%琼脂糖电泳检测后，初步筛选出155对扩增效果较好SSR 引物。上述155 对SSR 引物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，评价扩增片段的多态性、稳定性，挑选了22 对多态性高、扩增稳定、带型较清晰的SSR 引物（表1）。将最终得到的22 对SSR 引物合成FAM 标记的荧光引物用于毛细管电泳检测。

2.2 DNA指纹图谱构建

利用22 对多态性引物对83 份澳洲坚果种质进行毛细管电泳检测。选取引物P84、P118、P127、P132、P141、P163、P202、P211、P238 共9 对构建该群体的DNA指纹图谱。将每对引物扩增得到的多态性片段根据大小进行数字+英文字母形式的编码（表2），如引物P202 共有13 个多态性位点，从小到大依次编码为286（1）、286/288（2）、286/290（3）、286/292（4）、288（5）、288/290（6）、288/292（7）、288/294（8）、290（9）、290/292（A）、292（B）、292/294（C）、300（D）。9 对引物按照P211、P127、P238、P132、P118、P163、P202、P141、P84的顺序排列组合，将每份种质对应的引物位点编码统计组合，形成该种质的SSR 指纹图谱代码（表3）。如景哈57 的SSR 指纹图谱代码为H7A49A52I（图1）。对照表2，第1个字母“H”表示种质景哈57 在引物P211 中的扩增片段位于该引物多态性片段梯度中的第17位，第2个数字“7”表示种质景哈57在引物P127中的扩增片段位于该引物多态性片段梯度中的第7位，第3个字母“A”表示种质景哈57在引物P238中的扩增片段位于该引物多态性片段梯度中的第10位，其余代码依次类推。将每份种质的SSR指纹图谱代码导入在线条形码生成器，生成条形码DNA分子身份证，将每份种质的主要信息和SSR指纹图谱代码导入二维码生成程序，生成二维码DNA分子身份证，图2为部分种质的示例。

3 讨 论

3.1 SSR标记的选择

随着分子标记技术不断发展，多种DNA 标记被应用于植物DNA 指纹图谱的构建。相较于其他分子标记类型，SSR 标记有其独特的优势，目前仍然比任何其他传统的DNA 指纹方法更重要[15-16]。文雁成等[17]研究表明，与SRAP 标记相比，SSR 标记以其扩增谱带少、易于识别和统计而更适合用于引物组合法构建品种指纹图谱。李志远等[18]认为SNP 标记检测成本较高，鉴别相同数量品种所需要的SNP 标记数多于SSR 标记。早期SSR 标记开发存在成本高、周期长的问题，鉴于高通量测序费用的降低及越来越多物种基因组的发布，从已知序列识别重复位点开发SSR 标记变得简单、快速和经济。

SSR标记的检测技术主要为聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染及毛细管电泳的荧光检测。银染技术存在人工读取胶板误差较大问题。荧光标记的毛细管电泳检测无论是检测效率还是数据读取的自动化和准确性，都优于银染检测，特别是针对较大群体材料的检测[19-20]。与基于普通SSR标记的DNA指纹鉴定方法相比，基于SSR荧光标记的DNA指纹鉴定效率更高、结果更准确[21]。本次研究选择用聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物进行初步筛选，最后将多态性引物荧光标记用于供试材料的分析。兼顾了引物筛选中的费用成本及检测效率，获得了澳洲坚果高效的SSR引物。

3.2 指纹图谱的构建

DNA 指纹图谱是鉴别品种、品系的有力工具，非常适合于品种资源的鉴定工作[22]。在我国不同澳洲坚果种植区，存在新登记品种的主要特征相似、对同一优株不同命名的现象，易造成育种工作的重复及品种权纠纷。有些“假品种”与既有品种高度相似，苗期不易鉴别，后期给种植户带来一定的经济损失。DNA 指纹图谱可在早期从分子水平上为品种鉴别保护提供技术支持。随着澳洲坚果种质资源保存数量的增加，利用分子标记技术构建澳洲坚果种质资源DNA指纹图谱，可有效避免种质资源的重复性收集和保存。

指纹库构建时采用什么样的数据记录方式不仅影响数据库构建的难易程度，还影响数据库使用的方便程度[23]。早期构建数据库时根据谱带的有无进行1/0 形式编号的方法已很少使用，目前，对等位基因进行排列赋值的方法受到越来越多研究者的青睐。笔者选择扩增稳定、重复性好的特异引物按固定顺序排列组合，建立部分澳洲坚果种质的指纹数据库。并对各引物扩增的等位基因由小到大进行排列，以数字、英文字母的方式开始赋值，将每份材料的DNA数据转换为字符串，再将字符串转化为条形码及二维码形式，使其更具直观性，易被扫描识别，特别是二维码可添加文本图片信息，在资源圃种质资源的管理中应用更广。笔者在本研究中部分引物的等位基因位点可能随着建库规模的扩大而增加，造成数据库的变动。但笔者认为，鉴于目前澳洲坚果种质资源收集保存较少，该简易直观的建库方法可满足现阶段的工作需求。

4 结 论

基于澳洲坚果基因组设计、筛选的SSR 标记，可有效用于澳洲坚果种质资源的鉴定。

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Construction of DNA fingerprint of macadamia germplasm based on SRR markers

LI Zhiqiang,WU Chao,HE Xiyong,TAO Liang,GENG Jianjian,MA Jing,GONG Lidan*

(Yunnan Institute of Tropical Crops,Jinghong 666100,Yunnan,China)

Abstract:【Objective】Using molecular markers to construct DNA fingerprints is an effective strategy to identify plant germplasm.SSR(Simple Sequence Repeats)molecular markers are preferred for plant DNA fingerprinting constantly, due to their abundance, co-dominant inheritance, and reproducibility.The aim of this study was to construct macadamia DNA fingerprint using a series of SSR primers in order to provide technical support for macadamia nut germplasm collection and variety protection.【Methods】The genome DNA sequence of macadamia (M. integrifolia) was searched on NCBI website.The repeated base sites in the sequence were screened,and the primer 3 was used to design primers in batch.The standard primers were synthesized for subsequent test, according to the primer selection standard:the repeat unit is more than 2 bases,the number of repetitions is more than 8 times,and it is evenly distributed on the chromosome.The genomic DNA of the test material was extracted by CTAB method.The SSR-PCR reaction system is: 10 × Buffer 2 μL, 2.5 mmol·L-1 dNTP 0.4 μL, positive and negative primers 0.3 μL respectively,DNA template 2μL(20 ng·μL-1),5U Taq 0.2 μL,ddH2O 14.8 μL.The PCR amplification procedure was shown as fellows: Pre denaturation at 94 ℃for 5 min; Denaturation at 94 ℃for 30 s, renaturation at 65 ℃to 50 ℃for 30 s, extension at 72 ℃for 40 s, a total of 35 cycles;The final extension was made at 72 ℃for 3 min.4 materials with large phenotypic differences were selected for primer screening.Firstly, PCR amplification products were detected by 2% agarose gel electrophoresis,followed by PAGE detection with good amplification effect.Secondly,the initially selected PCR products plus the buffer denatured at 94 ℃for 10 min,and silver staining was made after 6%denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and primers with good amplification effect and polymorphism were selected.Thirdly, the screened SSR primers were labeled with 6-FAM fluorescent dye.After PCR amplification, 0.3 μL PCR product, 0.5 μL internal lane standards and 9.5 μL deionized formamide,were mixed and added to PCR plate,denatured at 95 ℃for 5 min,cooled at 4 ℃and then centrifuged.The capillary electrophoresis was performed with 3730xl sequencer.The allele loci of each primer were counted.The homozygous loci were recorded as X/X,the heterozygous loci were recorded as X/Y,the small fragment data in the heterozygous loci were in the front,the large fragment data were on the back,and the allele variation deletion loci were recorded as 0,for forming DNA fingerprint data.Referring to the methods of Yang Wenjuan and Guo Yanchun, the alleles obtained from each pair of primers were coded with numbers+English letters,and the numbers 1-9 were used in the order of molecular weight from small to large, and the parts beyond 9 were expressed with English letters A-Z, so as to construct the fingerprint code of the tested materials.DNA molecular ID cards in the form of bar code and quick response (QR) code were produced through online bar code generator and quick response(QR)code generator respectively.【Results】240 pairs of primers were initially selected,and detected by 2%agarose gel electrophoresis after PCR amplification.155 pairs of SSR primers were selected for 6% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.Finally, 22 pairs of SSR primers with stable amplification and high polymorphism were selected for fluorescence labeling,and 83 macadamia germplasm genotypes were obtained by capillary electrophoresis.The DNA fingerprints and DNA molecular ID card of the above materials were constructed using the combination of 9 pairs of fluorescent primers.For instance, primer P202 had 13 polymorphic loci, encoded in proper order as 286 (1), 286/ 288 (2),286/ 290 (3), 286/ 292 (4), 288 (5), 288/ 290 (6), 288/ 292 (7), 288/ 294 (8), 290 (9), 290/ 292 (a),292 (b), 292/ 294 (c) and 300 (d).The 9 pairs of primers were arranged and combined in the order of P211,P127,p238,p132,p118,p163,p202,p141 and P84,the coding information of each germplasm in each primer was counted.For example, the SSR fingerprint code of Jingha 57 is H7A49A52I, the first letter“H”indicates that the amplified fragment of germplasm Jingha 57 in primer P211 were ranked 17th in the primer polymorphism fragment gradient, and the second number“7”indicated that the amplified fragment of germplasm Jingha 57 in primer P127 were ranked 7th in the primer polymorphism fragment gradient,The third letter“A”indicated that the amplified fragment of germplasm Jingha 57 in primer P238 ranks first in the gradient of polymorphic fragment of the primer,and the other codes were analogized in turn.【Conclusion】SSR primers with high efficiency were obtained and used for rapid molecular identification of Macadamia germplasm resources.

Key words:Macadamia;SSR marker;Capillary electrophoresis;DNA fingerprint

中图分类号：S664.9

文献标志码：A

文章编号：1009-9980(2022)11-2028-08

DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.20220122

收稿日期：2022-03-14

接受日期：2022-05-27

基金项目：农业农村部热带作物种质资源保护项目（18210012）；云南省热带作物科技创新体系建设项目（RF2022-13）

作者简介：李志强，男，助理研究员，硕士，研究方向为澳洲坚果种质资源与育种。Tel：15368639770，E-mail：977782501@qq.com

*通信作者Author for correspondence.Tel：13887932361，E-mail：gld2001@126.com