柑橘褪绿矮缩病是一种危害柑橘的新型病毒病，最早发现于20世纪80年代末土耳其的地中海地区[1-2]，随后在泰国也有报道[3]。已有研究表明，柑橘褪绿矮缩病可侵染几乎所有的柑橘品种，仅甜橙具有一定抗性，柠檬、葡萄柚等最为敏感。植株发病后嫩叶边缘一侧或两侧有“V”形缺口和褪绿色斑点，成熟叶片皱缩、反卷、黄化，后期产量逐渐减低[4-5]。目前柑橘褪绿矮缩病已成为土耳其柑橘产业面临的头号病害[6]。
柑橘褪绿矮缩病的病原为柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV），属于双生病毒科（Geminiviridae）的Citlodavirus，为单链环状DNA病毒[7]。其基因组大约有3.6 kb，含有5个开放阅读框。CCDaV 的正义链编码外壳蛋白（V1）和运动蛋白（V2 和V3），互补链编码复制相关蛋白（C1 和C2）[8-9]。CCDaV 主要通过嫁接进行传播，纯化后的病毒粒子也具有侵染能力[10]。有报道，实验条件下CCDaV 还可通过杨梅类白粉虱（Parabemisia myricae）进行传播[8,11]。
自2015 年首次在中国云南瑞丽的尤力克柠檬上发现CCDaV 以来[4]，已陆续在中国广西、广东等地的泰国红宝石柚、三红蜜柚和墨西哥莱檬等多个柑橘品种检测到了CCDaV，且对广西等地的柚类生产造成了严重损失[12-13]。重庆尚未有该病发生的报道。重庆作为长江中上游柑橘优势区，以及国内最大的柑橘无毒苗木繁育基地，苗木交流频繁，柠檬、红宝石柚等感病品种都有引种、繁育和种植。因此本研究针对重庆目前种植柠檬、柚类的主要区县开展系统调查，以期掌握CCDaV在重庆柑橘产区的发生、分布及其分子特性，从而为明确CCDaV 传入重庆的主要途径，以及防控柑橘褪绿矮化病提供重要的理论依据。
1 材料和方法
1.1 田间调查
2020年1月—2021年12月从重庆北碚区、万州区、江津区等8个重要柠檬、柚类产区采集了11个品种的361份表现叶片皱缩、扭曲、黄化等疑似柑橘褪绿矮缩病症状的样品（表1）。取样时从每个植株的5 个不同方向上总共选取30 mg 老熟或展平的叶片组织。混合后使用植物基因组DNA 抽提试剂盒（Biospin）提取总DNA，-20 ℃保存备用。
表1 采样信息
Table 1 Specie and collection area of citrus samples used in this study
采样地Source北碚区Beibei样品数Sample number 2采样地Source万州区Wanzhou品种Cultivar 2号暹罗红Xianluohong 2泰国青柚Thailand Green pomelo红宝石柚Ruby Green pomelo越南青柚Vietnam green pomelo琯溪蜜柚Guanximiyou pomelo尤力克柠檬Eureka lemon三红柚Sanhong pomelo红心柚Hongxin pomelo泰国青柚Thailand Green pomelo红宝石柚Ruby Green pomelo红宝石柚Ruby Green pomelo金橙柚Jincheng pomelo琯溪蜜柚Guanxi pomelo泰国青柚Thailand Green pomelo三红柚Sanhong pomelo样品数Samplenumber 5 14 13 5 7 1品种Cultivar红心柚Hongxin pomelo三红柚Sanhong pomelo尤力克柠檬Eureka lemon 24永川区Yongchuan 1 7 4 5 14江津区Jiangjin 14綦江区Qijiang 21 3 5 5三红柚Sanhong pomelo红宝石柚Ruby Green pomelo尤力克柠檬Eureka lemon垫江晚柚Dianjiang late pomelo酸柚Sour orange金橙柚Jincheng pomelo尤力克柠檬Eureka lemon 5 16 11巫溪县Wuxi 34丰都县Fendu酸柚Sour orange 3 7 32 37 10 11 14 15垫江区Dianjiang红心柚Hongxin pomelo三红柚Sanhong pomelo金橙柚Jincheng pomelo晚白柚Wanbai pomelo 7
参照Zhou 等[15]的方法采用特性引物sense（5’-ACAAGACTATCATAGCACG AGACG-3’）和anti-sens（5’-TTTGAACTGTTTAAGTCCATCCC-3’）进行CCDaV检测。20 μL反应体系包含Green taq mix（vazyme）10 μL，10 mmol·L-1正反向引物各0.2 μL，总DNA模板2.0 μL，RNase-free ddH2O 7.6 μL。扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸50 s，35 个循环；72 ℃终延伸5 min。PCR 产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1.2 全序列测定
以CCDaV 阳性样品的总DNA 为模板，参照Yu等[9]的方法，用背靠背引物3202F（5’-GTTCTGTGTTTCGACCCGTTTCTTGCACTGG-3’）和3202R（5’-CCCCGGTTCTTCGACCTCCTCTCCGTA-3’）扩增CCDaV 的基因组。PCR 反应体系包括Prime STAR max（TaKaRa）12.5 μL，10 mmol·L-1正反引物各0.4 μL，模板DNA 2 μL，RNase-free ddH2O 4.7 μL。反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸3 min，35 个循环；72 ℃终延伸5 min。
PCR 产物纯化后连接于pCE2 TA/Blunt-Zero 载体（vazyme），并转化感受态细胞DH5α，每个毒株挑取12个阳性克隆送上海生工进行测序。经SeqMan软件拼接后得到CCDaV 的全基因组序列上传Gen-Bank（ON063221-ON063223）。
1.3 序列分析
将获得的CCDaV毒株WX-2-5、WX-4-6和WX-4-9 与GenBank 中41 个CCDaV 毒株的基因组序列用Megalign 法进行序列比对分析，分别采用SDTv.1.2 和RDP4软件分析毒株间基因组的相似性和重组分析，并用MEGA 11 软件采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树，自展值（bootstrap）设为1 000。所用CCDaV 参照毒株的信息见表2。
表2 本研究中用于分析的柑橘褪绿矮缩病毒毒株信息
Table 2 Accession numbers and collection area of Citrus chlorotic dwarf-associated virus(CCDaV)isolates used in this study for analysis
来源Origin毒株Isolate寄主Host来源Origin毒株Isolate寄主Host中国瑞丽Ruili,China YN-EL-9 YN-EL-19 YN-EL-26 YN-EL-71 YN-EL-72 YN-EL-77 YN-EL-93 YN-EL-94尤力克柠檬Eureka lemon长度Length/nt 3642 3642 3641 3641 3642 3641 3641 3641登录号Accession number MT680004 MT683769 MT680008 MT683766 MT680012 MT683770 MT683768 MT680003中国China柚中国南宁Nanning,China PL8 PL7 GX-RG-1 GX-RG-2 GX-RG-3 YN-RG-1 YN-RG-2 GD-sh-1 Pomelo红宝石柚Ruby Green pomelo长度Length/nt 3641 3642 3642 3643 3642 3642 3642 3640登录号Accession number MT655993 MT655992 MT680006 MT680011 MT683767 MT680007 MT680002 MT680001 YN-EL-131 CN001 YN-EL1 YN-EL2 YN-EL3 YN-EL3 YN-ML-66 3641 3642 3640 3640 3640 3640 3641 MT680010 KF561253 KX840467 KX840468 KX840469 KX840470 MT680009中国西双版纳Xishuangbanna,China中国红河Honghe,China中国广州Guangzhou,China中国江西Jinagxi,China泰国Thailand红宝石柚Ruby Green pomelo泰国青柚Thailand Green pomelo三红柚Sanhong pomelo柚pomelo红宝石柚Ruby Green pomelo土耳其Turkey JX Tha1-17 Tha1-19 Tha30 MER46 MER50 MER52柠檬Lemon酸橙Sour orange葡萄柚Grapefruit 3642 3642 3639 3640 3640 3641 3640 MW160707 MN509440 MN509441 MN509442 MG566050 MG566051 MG566052中国China YN-Th-168 PL1 PL2 PL3 PL4 PL5 PL6墨西哥莱檬Mexico lime塔西提莱檬Tahiti lime柚Pomelo 3641 3642 3643 3642 3642 3642 3642 MT680005 MT655986 MT655987 MT655988 MT655989 MT655990 MT655991中国重庆Chongqing,China HAT62 ADA74 ANT80 TK4 WX-2-5 WX-4-6 WX-4-9宽皮柑橘Mandarin明尼奥拉橘Minneola tangelo酸橙Sour orange柑橘Citrus红宝石柚Ruby Green pomelo 3640 3642 3641 3640 3642 3640 3641 MG566053 MG566054 MG566055 JQ920490 ON063221 ON063222 ON063223
1.4 致病性分析
将 获 得 的CCDaV 毒 株WX-2-5、WX-4-6 和WX-4-9 分别嫁接接种于一年生无病毒尤力克柠檬、费米耐劳柠檬、沃柑、纽荷尔脐橙、鸡尾葡萄柚、琯溪蜜柚和三红柚上。每个品种重复5 株，并各设置3 株无病植株作为负对照。嫁接后所有植株放置于25～28 ℃的温室中备用。每月采用1.1 中的方法进行检测，直至检测出病毒，同时观察植株症状。
2 结果与分析
2.1 田间调查结果
对采集的361份疑似感染柑橘褪绿矮缩病样品进行检测发现，3 份采自巫溪县同一个果园的红宝石柚样品感染了CCDaV，检出率为0.83%。其余柚类样品和柠檬样品都未能检测出CCDaV。所有感染了CCDaV 的红宝石柚嫩梢都出现了严重的叶片扭曲、皱缩症状。部分未感染CCDaV的红宝石柚也出现了叶片轻微或部分扭曲和皱缩，但所有阴性植株都没有发现退绿症状（图1）。
图1 田间红宝石柚健株（左）和感染柑橘褪绿矮缩病的病株（右）
Fig.1 Healthy(left)and Citrus chlorotic dwarf-associated-infected(right)Ruby Green pomelo plants in the field
2.2 CCDaV基因组分析
对来自重庆地区的3 株CCDaV 毒株进行全序列分析，结果显示，WX-2-5 分离株含有3642 nt，碱基组成为27.6%A、16.8%C、27.3%G、28.4%T；WX-4-6 毒株含有3640 nt，碱基组成为27.6%A、16.7%C、27.5% G、28.3%T；WX-4-9 毒株含有3641 nt，碱基组成为27.6%A、16.7% C、27.4% G、28.3% T。3个分离毒株的5’和3’非翻译区（UTR）都为194 nt和220 nt。与WX-4-6 毒株相比，WX-4-9 在1203 nt处多了个“T”，WX-2-5 在1203 和1204 nt 处都多出一个“T”。3个毒株与已报道的CCDaV基因组结构特征一致。
氨基酸序列比对显示，WX-2-5 毒株与41 个已知CCDaV 全序列的氨基酸序列之间有4 个氨基酸位点发生了变异，分别对应氨基酸序列的第303（C→L）、304（I→H）、341（S→N）、1163（F→S）位；WX-4-6与41个CCDaV毒株的氨基酸序列之间有3个共同氨基酸位点发生了变异，分别在第43（L→W）、567（H→R）和722（R→C）位。WX-4-9 除与WX-4-6 有相同变异外，在第633（S→N）和1137（R→M）位还发生了突变。
WX-2-5、WX-4-6和WX-4-9毒株间的核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%～99.9%和97.7%～99.7%；这3 个毒株与之前报道的41 个CCDaV 毒株间核苷酸和氨基酸相似性较高，分别为99.1%～99.7%和97.3%～99.7%。此外，在44 个CCDaV 全基因组序列间均未发现重组事件（图2）。
图2 柑橘褪绿矮缩病毒不同毒株基因组相似性分析
Fig.2 Similarity analysis of full-length nucleotide sequences of different Citrus chlorotic dwarf-associated virus isolates
2.3 系统发育分析
根据CCDaV 基因组构建的系统发育进化树（图3）显示：来源于土耳其的CCDaV毒株聚于相同的分支；泰国样品除Tha30 外，都和中国柚类上获得的CCDaV 毒株聚在一起。此外，巫溪样品WX-4-6 和WX-4-9，与广东沙田柚上的CCDaV 毒株聚在一簇；而巫溪样品WX-2-5与中国柚类上获得的CCDaV毒株聚于另一个分支。与来自土耳其的CCDaV毒株相比，中国和泰国的CCDaV毒株间的亲缘关系更近。
图3 柑橘褪绿矮缩病毒全基因核苷酸遗传进化分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of CCDaV isolates basing on nucleotide sequences
Bootstrap value ≥90%。参照毒株的地理来源见表1；分支长度代表遗传距离。
Complete gene Bootstrap value ≥90%.Geographic origin of referred isolates are listed in Table 1；Branch length represents the genetic distance.
2.4 致病性分析
嫁接接种1个月后，除对照植株外，所有接种植株都检测出了CCDaV。接种半年后，尤力克柠檬、费米耐劳柠檬和鸡尾葡萄柚表现出叶片皱缩。琯溪蜜柚和三红柚除叶片皱缩外，还出现了退绿症状。沃柑的新梢脉明、退绿。纽荷尔脐橙没发生明显的症状（图4）。
图4 柑橘褪绿矮缩病毒致病性分析
Fig.4 Pathogenicity analysis of Citrus chlorotic dwarf-associated virus
3 讨 论
重庆作为中国重要的柑橘产区和苗木繁育基地，不仅柠檬和柚类等特色品种的栽培面积较大，而且与国内外的柑橘种质资源交流频繁。前期研究显示，除葡萄柚外，柑橘褪绿矮缩病对柠檬、红宝石柚、泰国青柚、三红柚等多个柑橘品种的危害也较为严重[13]。本研究首次在重庆柑橘产区检测出CCDaV。虽然检出率较低，但已对当地柑橘生产造成了潜在威胁。此外，致病性分析还显示CCDaV 可能会对中国栽培面积最大的杂柑品种沃柑造成影响。因此本研究结果对于防治柑橘褪绿矮缩病具有重要意义。在调查的11 个柑橘品种中只有红宝石柚感染了CCDaV，由于随后在病株附近进行的大范围检测都未检测出病毒，也未发现其传播媒介杨梅类白粉虱（数据未显示），且该红宝石柚病株引自有CCDaV 发生记录的广西南宁。由此推测，该病可能主要是通过苗木引入重庆。因此，今后需进一步规范苗木市场，通过使用无病毒苗木，进而有效阻止柑橘褪绿矮化病发生范围的进一步扩大。此外，鉴于除杨梅类白粉虱外，CCDaV 可能还存在其他的媒介昆虫[11,13]，今后还需监测果园中昆虫的带毒情况，从而鉴定出可能的传播媒介。
前期研究显示，不同地理来源植株上的CCDaV毒株分子变异较小[14-15]。本研究对采自重庆的3 个CCDaV 毒株进行全序列分析的结果进一步证实，CCDaV毒株间的相似性很高，达99.3%，且基因组间未发生重组[13]。造成CCDaV 基因组变异较小的原因可能是其基因组较为稳定，不易因地理或寄主差异而发生显著的变异[13]。进化树分析显示，根据寄主类型和采样地的差异，CCDaV毒株被分为了4个不同的类群，其中来源于柚类和柠檬的CCDaV毒株分别位于独立的分支。此外，在重庆巫溪获得的3个CCDaV毒株分别聚于两个不同的簇，暗示其可能具有不同的来源。
4 结 论
研究首次在重庆柑橘产区检测出CCDaV。全基因组分析的结果暗示，其可能是随带病的红宝石柚苗木传入重庆。研究结果为进一步研究中国CCDaV 的流行病学和分子特征提供了重要的数据参考。
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