越冬冻害是中国北方酿酒葡萄最主要的气象灾害之一，是葡萄与葡萄酒产业的主要限制性因素。葡萄越冬冻害的发生取决于葡萄品种、栽培管理和冬前冷驯化水平[1-2]。大量的研究表明，不同品种葡萄的抗寒性不同[3-6]，山葡萄的抗寒性最强，其次是美洲种，欧亚种的葡萄最不耐冻；同为欧亚种，西拉的抗寒性明显弱于赤霞珠和马瑟兰[6-8]。不同的栽培管理如砧木嫁接、产量水平、病虫害等对葡萄抗寒性有明显的影响[9-12]。
植物获得抗寒性的适应过程称为冷驯化（Cold acclimation，CA）[1]，冷驯化是植物提高抗寒性和安全越冬的重要策略。植物在长期的进化和适应过程中，逐渐演化出一套高效且复杂的机制来应对低温胁迫。葡萄枝条ABA 可能参与了触发整个植物组织不同部位的冷驯化过程[13]。ABA 及其信号传导途径参与葡萄芽的冷驯化和去驯化[14]。ABA 在适应过程和抗冻能力方面似乎很重要，与特定基因表达相关，大量研究证实了COR基因的表达对于植物抗寒性和冷驯化十分关键[15]。Ca2+是低温下参与调节冷驯化应答机制中信号转导途径重要的第二信使[16-17]。Koussa 等[18]在不同的葡萄组织中观察到最高ABA 水平在葡萄休眠阶段。低温诱导下葡萄渗透调节物质增多，植物抗氧化酶活性升高，降低细胞质膜受伤害程度[19]。冷驯化过程除受低温影响外，还受光周期的影响[20]，Welling等[21]试验证据说明，低温和光在诱导植物冷驯化时是相互独立的。Mullins 等[22]发现，暴露于-5 ℃后，植物的抗寒性达到最强，冷驯化程度最完全。冷驯化过程是累积性的，它可能被停止、逆转和重启，所有这些都取决于温度的波动[1]。冷驯化过程在温度升高到一定程度（10 ℃以上）并维持一段时间后，植物抗寒性可以恢复到冷驯化以前的水平，称为去驯化[17]。灌溉也可能部分解除冷驯化，对葡萄抗寒性也有重要影响[23]。
葡萄获得抗寒性的冷驯化过程因气候的多变性，不同年份、地域冬前的冷驯化水平相差很大。目前，对自然冷驯化过程中葡萄抗寒力增强过程还不清楚，冷驯化开始、增强、结束的温度指标还没有建立起来。开展葡萄冷驯化对葡萄抗寒性研究中揭示越冬冻害形成机制，完善葡萄越冬冻害防御技术体系，减轻中国北方葡萄埋土越冬区冻害具有重要意义。本文拟通过大田试验取样，检测自然冷驯化过程中葡萄枝条的渗透调节物质、保护酶、电导率和过冷却点，揭示葡萄抗寒性对低温的响应过程，建立葡萄抗寒性与低温的关系模型，解析葡萄冷驯化低温指标，为摸清葡萄冬前抗寒力形成机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料选择欧亚种酿酒品种赤霞珠（Vitis vinifera‘Cabernet Sauvignon（CS）’，种植在银川市永宁县玉泉营立兰酒庄）和北红（‘Beihong’Vitis vinifera × V. amurensis,‘Beihong’（BH），种植在银川市永宁县玉泉营西夏王葡萄基地）的枝条（芽）作为实验材料。赤霞珠原产于波尔多，是长相思（Sauvignon Blanc）与品丽珠（Cabernet Franc）杂交的后代，是世界上最著名的红葡萄品种，在中国北方种植比例最高，其抗寒力相对较弱，代表了欧亚种葡萄的抗寒水平。北红是中国科学院植物所选用欧亚种玫瑰香（Vitis vinifera）与山葡萄（Vitis amurensis）杂交品种，抗寒力强，可以在贺兰山东麓产区露地越冬。采样树树龄5～7 a，南北行向种植，行距3.0 m，株距0.5 m，露地厂字形栽培，植株健壮，无病虫害，产量水平为4.5 t·hm-2。实验材料取自葡萄转色后1 a 生成熟枝条，每年自8 月份开始枝条取样，以后每隔5～9 d 采集1次样品，每个品种每次各采集10根枝条，3次重复；枝条要求粗度在0.5～1 cm。样品枝条经保鲜膜（石蜡）封两端后，置于样品袋中于4 ℃下存放待测。
1.2 试验方法
1.2.1 过冷却点和结冰点检测 以各供试品种枝条表皮作为测定部位，置于人工霜冻试验箱（型号：SDX-20）内，在待测部位固定T(K)-G 0.32 型热电偶温度传感器，FrosTem40 V2.0 数据采集系统与温度传感器连接，每10 s扫描采集1次数据，温度控制精度为±0.3 ℃。将监测的热电偶温度实时传输给电脑专业软件，自动连续绘制枝条温度变化曲线。每个处理枝条均取30个样本，分3组进行测定。
设置温度曲线模拟自然降温过程，枝条以3.0 ℃·h-1的速率从室温降至-25.0 ℃。
1.2.2 相对电导率的测定 将供试材料先用蒸馏水冲洗干净，用干纱布擦干后，避开芽眼，削成2～3 mm的薄片，混合均匀，称取2.00 g放入50 mL具塞试管中（每个处理3次重复），加20 mL去离子水，摇匀后在室温条件下静置24 h，在测定前再次摇匀，略微静置一段时间后用DDSJ-308F型电导仪测定初电导率R1，测定完毕后用玻璃塞封口，置于水浴锅中沸水浴30 min，取出冷却至室温，摇匀略微静置后测定终电导率R2。3次重复，采用（1）式计算相对电导率（RC）。
1.2.3 枝条含水量的测定 将供试品种的一年生枝条切成3～5 mm 的薄片混匀后，称取1.00 g，之后放入烘箱在110 ℃的温度下将枝条烘干至恒重。
1.2.4 其他生理指标的测定 剩余枝条避开芽眼，用切片机切成1～2 mm 厚的薄片，每个温度处理薄片平均分成3 份，混合均匀后迅速用液氮冷冻，放入-78 ℃超低温冰箱中保存。随机取样3次作为3次重复，测定其相关指标。
称取1.00 g 枝条放入预冷好的研钵中，加入适量pH=7.8 的预冷磷酸缓冲液，在冰浴上研磨成浆，加缓冲液冲洗研钵2～3次，使终体积为10 mL，将匀浆倒入离心管中，4 ℃条件下10 000 r·min-1 离心10 min，收集上清液保存在4 ℃冰箱中。所得残渣再用pH=7.8 的预冷磷酸缓冲液10 mL 提取1 次，合并两次上清液，提取液总体积为20 mL。使用此提取液测定以下生理指标[24]：
采用微波消解法测定Ca2+含量[25]，采用间苯二酚比色法测定枝条蔗糖含量[26]，采用ABA 试剂盒测定ABA含量（货号CSB-E09159P1）。
1.2.5 葡萄抗寒力指数（Cold resistance of grape）用以下公式计算。
式中，CR为葡萄枝条抗寒力指数，SDmax 为葡萄过冷却点最大值，SDmin 为过冷却点最小值。
1.3 气象数据及处理方法
气象数据来源于宁夏气象信息中心，基于2018—2021 年立兰酒庄和巴格斯酒庄区域自动气象站小时气象数据，分别整理成日平均气温（T）、最低气温（Tn）、降水量（R）等，日照时数（S）来自银川国家气候基准站同时段数据，分别整理成日日照时数（S），为统计分析需要，将平均气温、最低气温、降水量、日照时数等气象因子做了膨化处理，分别整理成节点日期前1、3、5、7、10 d 内平均气温，分别记为T1、T3、T5、T7、T10；节点日期当天和前3、5、7、10 d内平均最低气温，分别记为Tn、Tn-3 Tn-5、Tn-7、Tn-10；节点日期3、5、7、10 d 内最低气温，分别记为Tn3、Tn5、Tn7、Tn10；节点日期前1、3、5、7、10 d 内降水量，分别记为R1、R3、R5、R7、R10，节点日期前1、3、5、7、10 d 内平均日照时数，分别记为S1、S3、S5、S7、S10。
1.4 分析方法
数据分析使用SPSS 22.0软件，方差分析为单因素方差分析（One Way-ANOVA）；Logistics 方程采用DPS软件拟合；制图采用Origin 2018。
2 结果与分析
2.1 冷驯化过程中葡萄枝条生理指标与气象因子的相关性
分析阶段平均气温、阶段最低气温（Tn）、阶段平均最低气温（Tn-）、阶段降水量（R）、阶段平均日照时数（S）与枝条ABA、Ca2+、蔗糖（Sucrose，Su）、可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量，以及电导率（Conductivity，Con）、枝条过冷却点（Supercooling disadvantages，SD）、枝条结冰点（Freezing point，FP）、枝条含水率（Branch moisture content，BMC）的相关关系，制作了相关关系热图（图1）。结果表明，枝条过冷却点（SD）与枝条含水率（BMC）存在显著相关关系，随着BMC减少，SD降低，北红的枝条更耐冻。枝条过冷却点（SD）与10 d内平均气温（T10）、平均最低气温（Tn-10）呈极显著相关，其中Tn-10与SD关系最为密切（北红最大决定系数（R2）达到0.484 4，n=32，p=0.000 01；赤霞珠R2=0.323 8，n=30，p=0.001），说明葡萄抗寒力的增强是渐进的，随着低温的累计逐渐加强；北红枝条电导率（Con）与1～5 d最低气温存在显著正相关关系，最低气温越低，枝条电导率越大，其中Tn-3 与Con 关系最为密切（R2=0.135 4，n=33，p=0.035），但赤霞珠Tn与Con 并无显著相关关系。北红枝条BMC 与10 d 内最低气温Tn-10存在极显著正相关关系，其中10 d平均最低气温Tn-10与BMC关系最为密切（R2=0.443 6，n=33，p=0.000 023）；与7～10 d最低气温存在显著正相关关系，最低气温越低，枝条电导率越大，可见通过前期低温驯化，枝条的含水率随最低气温下降而降低。降水（R）和日照时数（S）与SD、Con和BMC无显著相关关系。
图1 2020—2021 年葡萄生化指标与气象因子的相关性
Fig.1 Heat map of correlation between grape biochemical indicators and meteorological factors in 2020—2021
A.2020—2021 年北红；B.2020—2021 年赤霞珠；C.2021 年北红；D.2021 年赤霞珠。
A.2020—2021 Beihong;B.2020—2021 Cabernet Sauvignon;C.2021 Beihong;D.2021 Cabernet Sauvignon.
统计分析发现，北红ABA与前7日平均日照时数（S7）有显著的负相关关系（R2=0.291 6，n=17，p=0.025），随着日照时间的减少，ABA 含量增加，有助于通过落叶回流养分提高抗寒性。而赤霞珠与日照时数相关不显著。ABA 与枝条蔗糖含量（Su）存在显著的负相关关系（R2=0.294 8，n=17，p=0.024）。而北红Su与10 d内平均气温、最低气温均存在显著的负相关关系，其中与T10相关性最显著（R2=0.360 0，n=17，p=0.011），说明蔗糖参与了冷驯化过程，并随着T10降低，蔗糖含量增加。研究还发现Ca2+参与了北红冷驯化过程，与Tn-5呈极显著的负相关关系（R2=0.434 3，n=17，p=0.004），随着5 日平均最低气温降低，Ca2+含量增加。降水量与ABA、Su和Ca2+含量相关不显著。
2.2 葡萄冷驯化过程中生理指标对低温的响应
2.2.1 过冷却点SD 和电导率Con 及枝条含水量对低温的响应 图2 显示，赤霞珠和北红枝条过冷却点（SD）能敏感地捕捉冷驯化信号，SD 随着近10 d平均最低气温Tn-10下降，至10 月25 日达到最大（图2），10 月29 日前后因农田大量灌水，影响了枝条过冷却点SD进一步下降，SD有所回升。SD对自然冷驯化过程较敏感，其变化过程与Tn-10降低过程非常一致。
图2 2020年枝条过冷却点随自然冷驯化变化
Fig.2 Variation of branch supercooling point with natural cold acclimation and low temperature in 2020
A.赤霞珠；B.北红。下同。
A.Cabernet Sauvignon;B.Beihong.The same below.
图3显示，随自然冷驯化过程气温降低，枝条电导率（Con）波动较大，2020年赤霞珠Con逐步升高，在9 月23 日近10 日平均最低气温Tn-10降到10 ℃左右达到最大，之后枝条Con 迅速降低，在经历了10月2日霜冻天气后又在波动中缓慢上升。北红则是随气温下降，先出现上升，在Tn-10低于10 ℃时达到最大值，后因霜冻天气影响枝条Con迅速下降，直到10 月20 日，Tn-10接近0 ℃后Con 降至最低，之后随Tn-10降低，葡萄果实采收，Con 逐步回升。Con 能较好地反映自然冷驯化过程。
图3 2020 年枝条电导率随自然冷驯化变化
Fig.3 Changes of branch conductivity with natural cold domestication in 2020
图4 显示，随着平均最低气温Tn-10降低，赤霞珠枝条含水率（BMC）呈波动下降趋势，9月23日BMC降到较低水平，后因出现降水（9月22日立兰酒庄降水达到7.8 mm，玉泉营10.3 mm）BMC又开始增加，直至10月25日Tn-10下降到2.5 ℃左右，BMC降至最低，之后随着灌水，BMC略有回升。北红BMC对低温的响应趋势与赤霞珠相似。
图4 2020 年葡萄枝条含水率率随自然冷驯化变化
Fig.4 Changes of water content of grape branches with natural cold domestication in 2020
2.2.2 蔗糖和Ca2+含量对低温的响应 图5显示，北红枝条蔗糖含量（Su）与10 d平均最低气温Tn-10密切相关（R2=0.442 2，n=17，p=0.004），随着平均最低气温降低，Su含量缓慢上升至9月13日开始下降（9月22日有大的降水），至10月20日达到最低，在Tn-10下降至5.0 ℃以下时，Su迅速增加。北红枝条Ca2+含量对5 d 平均气温T5有一定的响应（R2=0.418 6，n=17，p=0.005），随着T5降低，枝条Ca2+含量波动中上升，Ca2+含量波动可能受降水和灌溉的影响。Ca2+对Tn-5有较好的响应，说明Ca2+作为信使参与了冷驯化过程，可作为冷驯化程度的指示计。
图5 2021 北红枝条Su（A）与Ca2+（B）对低温的响应
Fig.5 Responses of sucrose(A)and Ca2+(B)to low temperature in 2021 Beihong branches
2.2.3 ABA对日照时间的响应 图6显示，ABA对7 d 内日照时数S7有很好的响应，当立秋日照减少，ABA含量在上升，至10月29日达到最大值（10月25日下降主要受10月24日灌溉影响），此时葡萄处于休眠期，贺兰山东麓大部分葡萄园开始埋土越冬；之后随日照时数上升，ABA含量下降到初始水平。
图6 2021 北红ABA 对日照时间的响应
Fig.6 Response of Beihong ABA to sunshine duration in 2021
2.3 冷驯化过程中抗寒力与低温的关系
2.3.1 不同冷驯化过程对葡萄抗寒力的影响 采用独立样本t检验对2020—2021年冷驯化过程中赤霞珠、北红的Tn-10（℃）、电导率（%）、过冷却点（℃）、枝条含水率（%）等参数进行显著性分析。结果表明，赤霞珠年际间过冷却点有显著性差异（p=0.004），电导率有显著性差异（p=0.006），其他指标无显著性差异；年际间北红过冷却点有显著性差异（p=0.019），其他指标无显著性差异。2020 和2021 年赤霞珠和北红品种间各指标无显著性差异（图7）。因此，选用SD表述葡萄品种和年际间抗寒力指标，构建抗寒力指数反映葡萄的冷驯化过程。
图7 2020—2021 赤霞珠和北红冷驯化参数年际差异
Fig.7 Interannual differences in cold domestication parameters of Cabernet Sauvignon and Beihong from 2020 to 2021
2.3.2 冷驯化过程中抗寒力与低温的关系模型 选用过冷却点建立与最低气温的关系模型，按照（1）式构建葡萄抗寒力指数，建立抗寒力指数CR 与10 d平均最低气温Tn-10的关系模型，结果列入表1。
表1 抗寒力CR 与Tn-10间的关系模拟
Table 1 Simulation of the relationship between cold resistance CR and Tn-10
品种Variety北红Beihong赤霞珠Cabernet Sauvignon时间Date 2020 2020关系模型Simulation model CR=7.608 4/[1+EXP(-1.978 1+0.268 770 Tn-10)]（3）CR=4.752 5/[1+EXP(-4.336 5+0.448 2 Tn-10)]（4）R2 n 0.919 9 0.697 9 12 12显著性检验Significance test 0.000 1 0.000 4
对（3）、（4）式求二阶导数，解出2020 年北红和赤霞珠模型的两个拐点（渐升期）和（缓升期），说明赤霞珠在最低气温低于12.61 ℃后，过冷却点迅速降低（抗寒力迅速增大），在最低气温降低至6.74 ℃后，过冷却点趋于最低（抗寒力趋于最大），以后随气温降低，过冷却点抗寒力缓慢降低。北红则在10.73 ℃后抗寒力迅速增大，在气温降到2.97 ℃后，抗寒力增加趋缓。北红的抗寒力上界大于赤霞珠，且对低温的响应快于赤霞珠，说明北红更抗寒（图8）。两年同品种葡萄抗寒力有一定差异，可能与2021年7—8月高温干旱的影响有关。
图8 最低气温与葡萄枝条抗寒力指数的关系
Fig.8 The relationship between the minimum temperature and the cold resistance of grape branches
为了找寻冷驯化过程的开始日期，建立了2020年北红和赤霞珠过冷却点与Tn-10的关系模型（图9）。两者满足二次曲线关系，对建立的关系模型求极值，当最低气温降低至17.7 ℃时，赤霞珠过冷却点有极大值。对应的最低气温出现日期为2020 年8 月15日（8月7日立秋）。同样，当最低气温降低到17.5 ℃时，北红过冷却点有极大值。对应的最低气温出现日期为2020年8月15日。因此，可以认为酿酒葡萄赤霞珠和北红都是在立秋天气转凉后启动冷驯化，北红和赤霞珠冷驯化启动温度基本相当。
图9 赤霞珠（A）和北红（B）过冷却点SD 与Tn-10的关系
Fig.9 Relationship between SD and Tn-10 of supercooling point of Cabernet Sauvignon(A)and Beihong(B)
3 讨 论
葡萄自然冷驯化过程非常复杂，受多种环境因素影响，光周期、低温等诱导下均可能启动冷驯化过程。为了检测葡萄冷驯化过程，需要对比分析研究期日长、低温、降水（灌溉）的变化，同时检测葡萄枝条生理生化指标，分析两者的响应关系，分析影响冷驯化过程的主导因子和冷驯化敏感生理生化指标，建立抗寒力与关键影响因子的关系模型，用于表征冷驯化过程开始、加强和结束时间及环境条件。
冷驯化过程是渐进的，低温是冷驯化过程的主导因子，低温与SD、Con、BMC、Su 含量和Ca2+含量关系密切；光照时间与ABA含量关系密切；降水（灌溉）降低了葡萄枝条的抗寒力。
生理生化指标对几天内温度、光照的响应关系比1 d内的更强，说明冷驯化过程是累积性的。葡萄枝条的过冷却点SD、电导率Con、枝条含水率BMC、蔗糖含量Su和Ca2+含量与最低气温，尤其是Tn-10有密切的相关关系，与光照时间关系不密切，说明最低气温是推动冷驯化过程的主导因子，宜作为冷驯化启动的初级信使。光照时间（光照周期）与ABA含量关系密切，与其他指标如SD、Con、BMC、Su含量、Ca2+含量等没有显著相关关系，日照时长对冷驯化过程的影响可能是通过日长变化诱导ABA产生，又通过ABA诱导抗寒相关基因和酶的表达，提高糖的合成和促进叶片养分的回流，从而提高葡萄抗寒性[14-15]。外源ABA可提高糖合成酶基因表达，也间接证实了上述结果[27]。值得一提的是，低温与ABA含量无显著相关关系，这与Chen等[28]的研究结果不一致，可能是光周期与低温对冷驯化的作用途径不同有关，低温和光周期独立参与了冷驯化过程[21]。也可能与不同树种对光周期和低温响应机制不同有关[20]。降水（灌溉）与冷驯化生理生化参数无显著相关关系，但降水（灌溉）会影响冷驯化过程中BMC、Ca2+含量、ABA 含量、Su 含量、SD、Con 等，主要通过稀释作用影响其渗透调节物质、激素等浓度水平，David[23]也观察到灌溉减低了葡萄抗寒性。Ca2+作为信号通过低温诱导从质外体Ca2+重新分配到共质体中参与了冷驯化过程[1]。低温还促进枝条含水率降低，与陈佰鸿等[29]的研究结果一致。随着温度降低，蔗糖含量上升，蔗糖含量升高与蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）的低温诱导相关，通过诱导蔗糖含量增加提高抗寒性，这与周兰兰等[26]研究结果一致。
SD能反映冷驯化过程的年际差异，对低温比较敏感，可以作为衡量冷驯化程度的生理指标。
2020—2021 试验结果表明，冷驯化过程中Su、ABA、Ca2+含量等呈上升趋势，BMC、SD 呈下降趋势，Con则趋势不明显。年际间赤霞珠SD和Con有显著差异，北红SD 年际间有显著差异，但Con 无显著差异。其他生理生化指标年际间无显著差异。因此，过冷却点SD对冷驯化过程的响应最敏感，不论品种、年份，SD 都能反映植物抗寒力随温度降低而增大的过程；电导率Con对冷驯化响应关系次之；枝条含水率BMC与冷驯化过程存在一定的响应关系，但BMC受降水和灌溉的影响较大。因此，采用过冷却点构建抗寒力指数CR反映葡萄枝条抗寒性最合适，其兼具年际稳定性和敏感性[30]，这与David[20]评价光周期对葡萄冷驯化影响所采用的指标相似。
冷驯化始于夏末天气转凉，气温低于18 ℃后冷驯化过程启动，最低气温与葡萄枝条抗寒力指数CR存在Logistics非线性关系。
过冷却点SD与Tn-10存在显著的二次曲线关系，求解方程发现，2020冷驯化过程始于立秋天气转凉以后，当Tn-10低于18 ℃，北红和赤霞珠陆续启动冷驯化过程。葡萄枝条抗寒力指数CR 与Tn-10存在明确的Logistics 关系，当Tn-10低至10～13 ℃时（2020 年约在秋分时节），葡萄枝条抗寒力迅速增大。当Tn-10降至2.0～3.0 ℃时（2020年约在霜降时节），葡萄抗寒力增强趋于平缓。其后随着气温继续降低，枝条抗寒力趋于最大。本项试验没有发现去驯化过程[31]，可能与2020—2021年气温整体呈波动中下降趋势，没有大幅度的回暖现象有关。
2021 年7—8 月的高温干旱对试验结果有一定影响，明显提高了前期葡萄枝条的ABA含量和SD；试验过程中葡萄园灌溉和自然降水等对试验结果也有一定的干扰。2020—2021 年自然冷驯化降温过程比较相似，还不能完全反映贺兰山东麓不同气候年型下自然冷驯化过程。实事上，不同地域和枝条的高度对其冷驯化过程也有一定的影响[31]。限于试验条件，本研究没有涉及葡萄枝条冷驯化过程的分子机制[32]。因此，葡萄自然冷驯化过程及影响的研究3有待今后继续深入展开。
4 结 论
葡萄冷驯化过程是一个非常复杂的生理过程，冷驯化强度受到葡萄遗传特性、光周期、低温、降水（灌溉）等外界因子共同影响。低温作为冷驯化的主导因子参与了葡萄冷驯化过程，随着立秋气温降低，葡萄枝条含水率下降，Ca2+和蔗糖含量增加。过冷却点能反映冷驯化过程的年际差异，对低温比较敏感，可以作为衡量葡萄枝条冷驯化程度的生理指标。葡萄枝条的抗寒力是渐进累积的，以Logistic非线性曲线形式增加。日照时间（光周期）对冷驯化过程有重要影响，与枝条ABA含量存在显著的正相关关系。降水（灌溉）降低了葡萄枝条的抗寒力。
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