无融合生殖是植物不经过雌雄配子融合而繁衍后代的一种特殊生殖方式，因其产生的后代基因全部来自于母本，可获得遗传结构上与母本完全相同的子代，利用其作母本能够固定杂种优势，保持基因的杂合性，后代性状不发生分离，具有极其重要的理论研究和育种应用价值[1-3]。果树遗传背景复杂，其重要经济性状在遗传上为多基因控制，常规的育种周期很长，无融合生殖在果树育种和生产上的价值就更为突出。近百年来很多学者都致力于探寻具备无融合生殖特性的果树类型及通过此途径改良果树育种的策略[4-6]。
无融合生殖鉴定的关键技术环节是隔离外来花粉，常规的方法是采用硫酸纸袋对雌花进行套袋隔离，如柑橘属及其近缘属、苹果属、胡桃属的无融合生殖研究[7-8]，但工作量大，操作费时。为了提高操作效率，有学者探讨其他可能的花粉隔离方法。董文轩等[9]在苹果属植物中研究了切除柱头和部分花柱的方法，发现其不能完全阻断外来花粉；李迎超[10]探讨了套袋、切柱头和聚乙烯醇封柱头3 种隔离方式在核桃上的应用效果，提出聚乙烯醇封柱头是最为高效的隔离方式；葛朝红等[11]在棉花自交研究上发现白乳胶点涂封闭花苞的方式可以实现花粉隔离。
君迁子（Diospyros lotus L.）又名黑枣、软枣，是我国北方广泛应用的优良柿树砧木。近年来，随着柿树产业的高速发展和甜柿品种的更新换代，越来越多的学者开始关注君迁子的种质资源，研究其遗传多样性[12-13]，着力筛选特异性状种质，开展矮化[14]、嫁接亲和性[15]、抗逆境胁迫[16]及离体再生[17]等方面的研究。河南科技学院柿属植物研究团队在2015 年发现了某些君迁子雌株在隔离花粉的情况下仍能产生具有生活力的种子，近年利用传统的硫酸纸套袋隔离花粉的方法对收集的资源进行了初步鉴定筛选，进一步确认了君迁子的很多单株确实具有无融合生殖特性[18-19]。
在研究实践中发现，君迁子雌花花柄非常短，且密集地着生在枝条的基部，很难像其他果树进行单个花的套袋隔离，通常采用硫酸纸将整个枝条覆盖再用曲别针封套，不但费工费时、破坏邻近叶片，而且由于君迁子花期较其他果树偏晚、气温偏高常导致袋内落花焦叶现象严重。另外，在进行大规模的资源筛查或在山区野外开展无融合生殖种质鉴定研究时，这样的隔离操作效率极低，容易错过花期或遭到外来因素的干扰[20]。基于以上认识，河南科技学院柿属植物研究团队近年着力于研发高效花粉隔离技术，经过前期摸索试验，发现白乳胶点涂柱头的方法操作简单，也有花粉隔离效果，但对其能否完全隔离花粉缺乏信心。笔者在本研究中拟利用荧光显微观察法探明白乳胶在君迁子花粉隔离中的确切效果，建立一种适于君迁子的高效花粉隔离技术，提高无融合生殖种质的鉴定效率，为深入解析君迁子无融合生殖特性提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 材料
试验材料来自河南科技学院柿属植物种质资源收集圃。选择生长健壮、花朵数量适宜、结实率较好且结实稳定的成龄君迁子进行研究，授粉树是通过多年花粉萌发试验选择的雄xy-1单株，其花瓣玫红色，花量大，花粉萌发率高，花期与供试雌株相遇。无融合生殖鉴定的22 个雌株中除了7 株（xx-2、xx-3、xx-4、xx-5、xx-7、xx-8、xx-10）分布在新乡市周边外，其余15株均来源于该资源圃。
1.2 方法
1.2.1 君迁子花粉隔离处理方法 2018 年5 月上旬，在雌花呈大花苞状态时，对选定单株xx-6 进行花粉隔离处理。隔离处理方法包括硫酸纸套袋、尼龙网套袋和白乳胶封柱头，以自然授粉作为对照（图1）。（1）硫酸纸袋套袋隔离花粉法。先摘除已经开放的或发育过小的雌花，然后对单朵雌花进行单花套袋，也可对生长较为密集的多朵花一起套袋，用大头针或曲别针封口。（2）尼龙网套袋隔离花粉法。使用特定孔径（38 μm）的尼龙网套袋时，在套袋前先将尼龙网裁剪成合适的大小，折叠（折叠成口袋状，如图1-B）后利用订书机固定，先摘除已经开放的或发育过小的雌花，然后可对单朵雌花进行单花套袋，也可对生长较为密集的多朵花一起套袋，最后用大头针或曲别针封口。（3）白乳胶封柱头隔离花粉法。在多数雌花处于大花蕾期时，于无风晴天选择呈大花苞状态的雌花，小心去掉雌花花冠，露出雌花柱头，利用棉签蘸取适量白乳胶（得力牌，60 mL）涂抹君迁子柱头，以完全包裹柱头为宜。白乳胶用量为每朵单花0.5～1.0 mL。（4）自然授粉（CK）。随意选取花苞进行自然授粉，标为对照。每种处理完成后及时进行挂牌标记，标明处理方法、处理花苞数以及处理时间。隔离处理12 h 后进行取样并利用FAA 固定液保存，每个处理取样不少于30 个。本试验采用苯胺蓝染色法。利用Nikon 的ECLIPSE Ti 荧光显微镜，在4×镜下用DAPI 光观察不同隔离处理下的隔离效果。
图1 不同的君迁子花粉隔离方式
Fig.1 Different pollen isolation methods of date plum
A.硫酸纸袋套袋；B.尼龙网套袋；C.白乳胶封柱头；D.自然授粉。
A.Sulfuric acid paper bag bagging;B.Nylon mesh bagging of date plum;C.White latex seals the stigma;D.Natural pollination of date plum.
1.2.2 白乳胶隔离效果的荧光显微观察鉴定 2019年5月上旬，利用白乳胶点涂的方法在雌株xx-10上处理超过250个花朵。对点涂白乳胶的单花分别在处理后1、3、5、8、12、24、48、72 h，用提前收集的雄xy-1花粉进行人工授粉，并做好挂牌标记，每个时间点处理数量不少于30个，单花授粉12 h后切取完整幼果用FAA 固定液固定，4 ℃冰箱中保存。在同一供试单株上以不涂白乳胶的正常人工授粉为对照，并于授粉后72 h内间断取样固定保存。采用苯胺蓝染色法，利用荧光显微镜（Nikon Ci-S）观察不同处理下君迁子柱头上的花粉萌发情况，分析判断白乳胶封柱头的隔离效果。
1.2.3 君迁子无融合生殖单株的鉴定 2020年5月上中旬，对供鉴定的22株君迁子挂牌标记。在每个单株多数花处于大花蕾期时，摘除已开放的雌花，对余下的花进行白乳胶花粉隔离处理（单人完成22株树的全部处理），统计花量。10 月下旬待果实完全成熟后统计坐果数量、有种子的果实数量、果实中的种子数量，计算坐果率、无融合生殖单果平均结种数、无融合生殖果实比率和百个隔离雌花获种数。
无融合生殖单果平均结种数=隔离处理果结种数量/隔离后有种子的果实数量；
无融合生殖果实比率/%=隔离处理后有种子的果实数量/隔离处理后坐果数量×100。
2 结果与分析
2.1 君迁子不同花粉隔离方法效果的荧光观察鉴定
利用荧光显微镜对不同花粉隔离处理下君迁子花粉管生长情况进行观察。如图2 所示，硫酸纸袋封柱头（图2-A）、尼龙网封柱头（图2-D）、白乳胶封柱头（图2-C）、以及自然授粉（图2-F）4 种花粉隔离方法，每种隔离方法均能隔离君迁子花粉，但隔离效果存在差异，如图2-B 和图2-E 所示，在利用硫酸纸袋套袋和尼龙网进行套袋时，在部分柱头上依然能看到萌发的花粉，隔离成功率仅为50.0%和54.5%，而白乳胶封柱头花粉隔离法的隔离成功率最高，为83.3%。
图2 君迁子不同花粉隔离方式的荧光观察鉴定
Fig.2 Fluorescence observation and identification of different pollen isolation methods of date plum
A～B.硫酸纸袋套袋后的柱头表面；C.白乳胶封柱头后的柱头表面；D～E.尼龙网套袋后的柱头表面；F.自然授粉后的柱头表面。
A-B.The surface of the stigma of a sulphuric acid paper bag;C.The surface of the stigma after the white latex seal;D-E.Stigma surface after nylon mesh bagging;F.Stigma surface after natural pollination.
2.2 君迁子不同花粉隔离操作的工作效率
君迁子不同花粉隔离处理下的工作效率也有较大差异。本试验的每个花粉隔离处理分别处理了23个花苞，3次重复，利用硫酸纸袋套袋隔离花粉操作用时，平均为10 min；尼龙网处理为18 min；白乳胶封柱头花粉隔离法平均用时为9 min。
2.3 常规人工授粉条件下君迁子花粉的萌发情况
常规人工授粉情况下，君迁子雄xy-1花粉在雌株xx-10柱头上能正常萌发，授粉后2 h柱头上已经有大量的花粉管萌发出来；授粉3 h时花粉管已到达花柱的中部；5 h时有花粉管伸长至花柱底部，8 h时子房基部可以看到花粉管（图3）。
图3 常规人工授粉条件下君迁子花粉的萌发进程
Fig.3 Pollen germination process of date plum under artificial pollination
A.2 h 柱头表面；B.3 h 柱头中部；C.5 h 柱头底部；D.8 h 子房底部。Pg.花粉粒；Pt.花粉管。
A.2 h stigma surface;3 h middle of stigma;5 h bottom of stigma;8 h bottom of ovary.Pg.Pollen grain;Pt.Pollen tube.
2.4 白乳胶对君迁子花粉的隔离效果
在君迁子雌花大蕾期，对柱头进行白乳胶点涂处理后间隔1、3、5、8、12、24、48、72 h 人工授粉。在后期取样固定、压片过程中可以肉眼观察到点涂白乳胶形成的隔离膜，在荧光显微镜下发现供试的柱头样本上均未看到花粉粒的存在。表明白乳胶涂抹柱头确实完全有效隔离了点授的花粉（图4-A～H）。
图4 白乳胶对君迁子花粉的隔离效果
Fig.4 Isolation effect of white latex on stigma of date plum
A～H.君迁子点涂白乳胶后1、3、5、8、12、24、48、72 h 授粉柱头样本上均未看到花粉粒。A.1 h 柱头表面；B.3 h 柱头表面；C.5 h 柱头表面；D.8 h 柱头表面；E.12 h 柱头表面；F.24 h 柱头表面；G.48 h 柱头表面；H.72 h 柱头表面。
A-H.No pollen grains were found on stigma pollinated in 1,3,5,8,12,24,48,72 h,respectively after coated with white latex in date plum.A.1 h surface of stigma;B.3 h surface of stigma;C.5 h surface of stigma;D.8 h surface of stigma;E.12 h surface of stigma;F.24 h surface of stigma;G.48 h surface of stigma;H.72 h surface of stigma.
2.5 白乳胶花粉隔离法在君迁子无融合生殖鉴定中的应用
花粉隔离处理后的坐果、结种情况是判断君迁子单株是否具备无融合生殖能力的第一步。本文中无融合生殖率的计算参考闫弯弯[18]所提出的计算方法，并结合连续多年的数据来确定指标的稳定范围。其中100 个套袋果获得种子数＞40 粒无融合生殖能力高，20～40 粒无融合生殖能力中等，＜20 粒为无融合生殖能力低。利用白乳胶花粉隔离法，对选定的22 个君迁子雌株进行处理鉴定。结果表明，xx-8、xx-10、xx-20、xx-24、xx-29、xx-31、xx-33 等7 株君迁子隔离花粉后不能正常坐果，初步判定这些单株不具备无融合生殖能力；xx-13、xx-15 2 个单株套袋后结实不结种，说明其也不具备无融合生殖能力，但可能具备单性结实能力；xx-18 君迁子单株果实有种子，但当年种子均未成苗，鉴定其无融合生殖能力还需要更多的证据。其余12 个单株花粉隔离后均能产生具有生活力的种子，说明具备无融合生殖特性，其中xx-7、xx-37 为高无融合生殖单株，隔离百个雌花可获得超过40 粒种子（表1）。
表1 白乳胶花粉隔离法鉴定22 株君迁子雌株无融合生殖能力
Table 1 The apomictic ability of 22 individual date plum identified by pollen isolation method of sealing stigma with white latex
3 讨论
3.1 不同花粉隔离方式操作的工作效率存在差异
君迁子不同花粉隔离处理下的工作效率也有较大差异。笔者研究了尼龙网套袋、硫酸纸袋套袋和白乳胶封柱头3 种不同的花粉隔离方式的工作效率，试验结果表明，用尼龙网套袋隔离时操作复杂，用时最长，其次为硫酸纸袋套袋，而在利用白乳胶封柱头花粉隔离法进行花粉隔离时操作相对简单，用时较短。其中工作效率还和处理时花朵是否集中在一起有关，在花朵集中的前提下，硫酸纸袋套袋和尼龙网可以1个袋子套多朵花，操作时间会相应缩短，但1个袋内套多个花往往易造成严重的落花现象，影响君迁子正常的生长发育，故从整体实际操作上来讲，采用白乳胶封柱头的方法隔离君迁子花粉更为简单。
3.2 不同花粉隔离操作的便捷性与有效性
植物的花性特征和花器构造各有特点，可能极为相似，也可能极为不同，因而用于育种研究的高效花粉隔离方式也可能会有差别。李迎超[10]在核桃无融合生殖研究中提出，聚乙烯醇封柱头可代替套袋进行花粉隔离。笔者在前期亦曾使用聚乙烯醇进行花粉隔离，但发现其黏性较强，点涂时因君迁子柱头小，易导致操作污染幼果，且聚乙烯醇使用时需要提前熬制，过程较为繁琐。白乳胶的重要成分之一为聚乙烯醇[21]，葛朝红等[11]在用白乳胶点涂研究棉花不同品系间自交的成铃率时认为，白乳胶可以实现花粉隔离，但操作较为费工。本研究表明，白乳胶具有成膜性好、固化速度快等特点，在风干后形成保护膜，能完全有效隔离外来花粉，且不影响果实的子房发育。与硫酸纸袋套袋隔离方法相比，无需多次套袋、取袋，省工省时，相较聚乙烯醇而言，白乳胶为成熟的商品，在市场上比较常见，购买方便且成本低廉，可以尝试在其他果树上应用该方法开展相关研究。
3.3 白乳胶花粉隔离法在无融合生殖鉴定中的应用
无融合生殖育种的关键环节就是确定该植物是否具备无融合生殖特性。在果树生产中，常规的鉴定方法就是利用套袋进行花粉隔离，使用较多的是硫酸纸袋套袋和尼龙网套袋等。本试验最先也是采用传统套袋的方式对资源圃中无融合生殖单株进行鉴定和筛选，使用了硫酸纸袋套袋和尼龙网套袋的方法隔离君迁子花粉，对君迁子种子资源进行筛选和鉴定，但是套袋导致君迁子出现了严重的落花现象，限制了后期育种工作的进程，所以笔者在本试验中开始探索新的花粉隔离方式。在核桃等其他果树无融合生殖研究的启发下，笔者在第二年增加了聚乙醇胶封柱头、白乳胶封柱头等的花粉隔离方法，并结合荧光显微镜观察隔离后君迁子的柱头上的花粉萌发情况，最终筛选出白乳胶封柱头花粉隔离法是最适合君迁子在无融合生殖研究中使用的花粉隔离方式。利用白乳胶封柱头花粉隔离法不仅可以避免套袋导致的落花现象，而且还节省人力物力，省工省时，可明显提高君迁子无融合生殖种质的鉴定效率，为君迁子无融合生殖高效育种提供技术支持。
4 结论
白乳胶花粉隔离法是一种适于君迁子的高效花粉隔离技术，可以明显提高无融合生殖种质的鉴定效率，能够为深入解析君迁子无融合生殖特性提供可靠的技术支持。
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