苹果属于蔷薇科苹果属植物，是世界四大水果之一[1]，中国是世界上最大的苹果生产和消费国，苹果种植面积和产量均超过世界总量的50%。苹果产业在促进农民脱贫致富、助力乡村振兴以及推进农业供给侧结构性改革等方面起到重要作用[2]。由于我国复杂的地理条件和气候条件，苹果春冬季节易遭到冻害，严重的低温冻害会使树体受损，影响来年的产量和品质，造成严重经济损失，温度是影响苹果产业发展、降低经济产量和效益及限制苹果栽培区域扩大的一个重要因素。我国北方冬季容易发生冻害，抗寒性差的苹果树枝干受冻严重，甚至有些地区会使树木出现抽条现象[3]。低温冻害成为我国苹果产业发展的限制因素[4]。由此，提高苹果树的抗寒性尤为重要。嫁接是苹果主要的繁殖方式，砧木直接影响接穗的抗寒性，正确选择砧木，可以提高苹果树的抗寒性[5]。评价和鉴定不同苹果砧木的抗寒性，筛选出抗寒性强的苹果砧木，对促进苹果产业发展、提高苹果经济产量及效益、扩大苹果的栽培区域具有重要的指导意义。
近年来，采用人工模拟低温处理的方法研究抗寒性的报道有很多。赵国栋等[6]和王依等[7]采用人工低温模拟的方法通过半致死温度及生理生化指标的测定，综合评价出野生苹果和酿酒葡萄的抗寒性。有研究指出，在自然越冬条件下研究抗寒性比采用人工模拟低温处理的方法研究抗寒性更能真实反映抗寒能力且更具现实意义[8]。因此，笔者在本试验中以5 种新选育的苹果砧木和4 种抗寒性已被评价过的砧木[9-10]为试材，对其自然越冬胁迫下的1年生苹果休眠枝条的半致死温度、SOD和POD酶活性，以及超氧阴离子、可溶性蛋白、MDA、游离脯氨酸、ABA、可溶性糖、淀粉含量等生理指标进行测定，研究各苹果中间砧木枝条在自然越冬胁迫下生理特性的变化，并利用主成分分析法综合评价比较各苹果中间砧的抗寒性，筛选出抗寒性强的优良苹果中间砧，以期为苹果抗寒砧木的栽培生产应用、引种和选育提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试材为9种苹果中间砧（5种新选育的抗寒性未知的砧木，编号分别为100、147、9-3、1-8、22#46，4种抗寒性已被评价过的砧木（GM256、SH40、M9、MM106）作为对照，采取1年生休眠期枝条为试验材料，所用试材都嫁接在无融合生殖的平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）砧木上。试材生长地点位于保定市河北农业大学西校区，该地区属暖温带大陆性季风气候区，四季分明，春秋凉爽，夏季多雨，冬季寒冷干燥。
1.2 试验方法
1.2.1 半致死温度和生理指标（1）取材与处理。分别于2020年11月7日、2020年12月7日、2021年1月5日、2021年3月5日取样，各取样日的日最高气温分别为20、4、-2、10 ℃，日最低气温分别为3、-7、-15、1 ℃，日 平 均 气 温 分 别 为12.21、-1.96、-7.33、4.29 ℃。每种砧木采取长势一致、健壮无病虫害的1 年生休眠枝条（直径约0.5 cm）。各种砧木枝条分为2部分：一部分枝条采后立即清洗干净，带回实验室后立即取其枝皮，迅速用锡纸包好，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱，用于测定生理生化指标；另一部分枝条采后用蒸馏水和去离子水清洗干净，每种砧木按6个低温处理温度分装6个塑料自封袋中（袋中喷去离子水防止枝条发生过硬现象），每个袋中放5个枝段（每段长约3 cm），然后放置于盛有保鲜冰块的取样箱中带回实验室进行不同低温处理，测定相对电导率，求低温半致死温度。
（2）低温处理。低温处理参照金明丽[5]的方法。使用可变温的超低温冰箱进行人工冷冻处理，每次设定6 个温度梯度（表1），以4 ℃为空白对照，其他几个温度包括所有使样品成活的温度和所有使样本致死的温度。降温速率为6 ℃·h-1，在温度达到设定温度后放置12 h。之后拿出在0 ℃冰箱中静置解冻8 h，再于4 ℃冰箱中解冻放置24 h后测定相对电导率。
表1 4 次低温处理测定抗寒性所设温度
Table 1 Set temperature for cold resistance determination after 4 low temperature treatments
日期Date 2020-11-07 2020-12-07 2021-01-05 2021-03-05设定温度Temperature/℃4444-8-8-10-4-22-22-22-20-34-34-45-28-45-50-55-36-55-60-65-45
（3）测定相对电导率。参照金明丽[5]、杨雪[11]和张钢[12]的方法计算相对电导率（E）和半致死温度（LT50），测定电导率的方法略有改动。将已低温处理好的枝条切成15 mm 长的枝段，从中间劈开，放入装有10 mL 超纯水的试管中，每个处理5 次重复。放到摇床上震荡24 h，震荡完毕后用DDS-307A 型电导率仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）测定初电导植R1 和空白电导植R0。然后于水浴锅中沸水浴30 min，再次放到摇床上震荡24 h，之后测终电导植R2。按E（%）=（R1-R0）/（R2-R0）×100 计算得出各处理的相对电导率E。将各处理温度和相对电导率用SPSS 21.0 软件拟合Logistic 方程，求拐点温度，即为低温半致死温度（LT50）。
（4）测定相关生理指标。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定[13]；超氧化物歧化酶活性采用四唑氮蓝光还原法测定[5]；过氧化物酶活性采用愈创木酚法测定[5]；超氧阴离子含量采用羟胺氧化法测定[14]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[5]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定[15]；脯氨酸含量采用茚三酮显色法测定[15]；淀粉含量采用蒽酮比色法测定[5]；脱落酸含量采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定[16]。
1.2.2 冻害形态指标测定 分别于2021 年11 月20日、2021 年12 月16 日、2022 年1 月11 日、2022 年3月2 日取样，各取样日的日最高气温分别为9、8.6、3、13.6℃，日最低气温分别为4.5、-5.8、-12.7、-4.6℃，日 平 均 气 温 分 别 为7.28、0.57、-5.25、5.61℃。每种砧木采取长势一致、健壮无病虫害的1年生休眠枝条，带回实验室进行观察记录。采用目测观察结合显微镜观察记录枝条切面的褐变情况[17]，参照赵同生等[18]的方法进行冻害分级，按木质部变褐面积的大小将冻害分为10 级，计算冻害指数，3次重复，每次4个枝段。
冻害指数（%）=［Σ（冻害级次×枝段数）/（10×枝段总数）］×100。
1.3 数据处理
利用SPSS 21.0 软件进行logistic方程拟合求低温半致死温度。采用Microsoft Excel 2010软件对试验数据进行整理和作图。利用SPSS 21.0 进行单因素方差分析，并用Duncan 检验（p ＜0.05）进行差异显著性分析。运用SPSS 21.0并采用Z-score对数据进行标准化处理和主成分分析，综合评价抗寒性。
2 结果与分析
2.1 人工低温胁迫处理下各苹果砧木枝条半致死温度（LT50）的变化
根据在不同低温胁迫处理下测得各苹果砧木枝条的相对电导率，并结合Logistic 方程求得各苹果砧木的低温半致死温度及拟合度，结果如表2 所示。在整个自然越冬胁迫过程中，各苹果砧木枝条半致死温度变化与自然冬季气温变化趋势相对应，呈先降低后升高的趋势。即在2020 年11 月7 日至2021年1月5日，随自然气温的逐渐降低，各苹果砧木在适应外界冷胁迫环境条件的变化后，抗寒性提高，相应的半致死温度随之降低，且均在1月份自然温度最低、胁迫最严重时半致死温度最低。随后在2021 年1 月5 日至2021 年3 月5 日，气温回升时，半致死温度也随之上升。各苹果砧木枝条在低温胁迫下利用Logistic 方程拟合的回归曲线拟合程度较好，拟合结果较精确可靠，可信度高。在整个自然越冬过程中，100、147、9-3和GM256半致死温度较低，表现出较强的抗寒性。MM106、M9 和22#46 半致死温度较高，表现出较差的抗寒性。
表2 人工低温胁迫处理下各苹果砧木枝条半致死温度（LT50）及拟合度
Table 2 Half lethal temperature(LT50)and fitting degree of branches of apple rootstocks under artificial low temperature stress
砧木Stock SH40 MM106 M9 GM256 100 147 1-8 22#46 9-3 2020-11-07 LT50/℃-16.172-14.751-15.587-17.737-18.279-17.180-17.655-14.052-16.117相关系数R2 0.990 0.978 0.973 0.986 0.982 0.980 0.974 0.987 0.997 2020-12-07 LT50/℃-23.430-21.304-22.763-23.156-26.926-23.643-23.799-23.413-27.783相关系数R2 0.993 0.996 0.968 0.995 0.981 0.994 0.992 0.995 0.96 2021-01-05 LT50/℃-31.321-26.618-30.943-35.890-44.240-45.337-32.278-31.028-45.087相关系数R2 0.991 0.991 0.994 0.987 0.988 0.984 0.987 0.983 0.989 2021-03-05 LT50/℃-24.818-26.549-26.778-31.026-23.458-24.808-26.225-23.531-25.310相关系数R2 0.954 0.994 0.975 0.970 0.990 0.992 0.989 0.975 0.979
2.2 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条的冻害指数情况
对自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条的组织褐变程度进行观察，求得的冻害指数情况如表3 所示。各苹果砧木枝条的冻害指数变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。在2021年11月20日MM106、M9和22#46表现出轻微冻害，其他砧木未出现冻害。2021 年12 月16 日至2022 年1 月11 日，低温胁迫加剧，各苹果砧木枝条均发生轻微冻害，木质部出现变褐情况加重，冻害指数升高，在2022 年1 月11 日至2021 年3 月2 日随着冬季气温的回升，低温胁迫减轻，冻害指数有所降低。在整个自然越冬胁迫过程中，100、147、9-3和GM256 的冻害指数相对较低，说明受冻害影响小。而MM106、M9和22#46的冻害指数相对较高，褐变情况严重，说明受低温影响较大。
表3 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条的冻害指数变化情况
Table 3 Changes of freezing injury index of branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
注：表中数据为2021—2022 年各砧木冻害发生情况。不同小写字母表示砧木间差异显著（p＜0.05）。下同。
Note:The data in the table showed the freezing damage of rootstocks during 2021 to 2022. Different small letters indicate significant difference among different rootstocks(p＜0.05).The same below.
砧木Stock SH40 MM106 M9 GM256 100 147 1-8 22#46 9-3冻害指数Freeze injury index of branches/%2021-11-202021-12-162022-01-112022-03-02 0.00 b 0.83 ab 0.83 ab 0.00 b 0.00 b 0.00 b 0.00 b 1.67 a 0.00 b 4.17 ab 6.67 a 5.00 ab 3.33 b 3.33 b 3.33 b 5.00 ab 6.67 a 3.33 b 5.00 b 10.83 a 10.00 a 4.17 b 4.17 b 4.17 b 5.00 b 10.00 a 4.17 b 2.50 bc 4.17 ab 4.17 ab 2.50 bc 1.67 c 2.50 bc 2.50 bc 5.83 a 1.67 c
2.3 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条生理指标的变化
2.3.1 丙二醛（MDA）含量的变化 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中MDA 的含量变化情况如图1所示。大多数苹果砧木枝条MDA含量变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020年11月7日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的MDA含量随之升高，在2021年1月5日至2021年3月5日随着自然冬季气温的回升，低温胁迫减轻，MDA 含量有所降低。1-8的MDA 含量变化略有差异，在整个越冬胁迫中MDA 持续升高，且在3 月份MDA 含量升至最高。SH40、MM106、M9、GM256、100、147、22#46 和9-3 均 在1 月 份 温 度 胁 迫 最 严 重 时MDA 含量升至最高，且各品种间表现出显著差异。在整个自然越冬胁迫过程中，100 和147 的MDA 含量始终处于较低水平，显著低于其他砧木。22#46的MDA含量一直处于较高水平。
图1 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条丙二醛（MDA）含量的变化
Fig.1 Changes of malondialdehyde(MDA)content in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
2.3.2 保护酶活性及超氧阴离子产生速率的变化（1）超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化。自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中SOD 活性变化如图2 所示。各苹果砧木枝条SOD 活性变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020年11月7日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的SOD活性随之升高，且各苹果砧木均在1 月份温度胁迫最严重时SOD 活性升至最高。在2021 年1 月5 日至2021 年3 月5 日气温逐渐回升时，随着低温胁迫的减轻，各苹果砧木枝条SOD活性有所降低。在整个自然越冬胁迫过程中，100、147和GM256的SOD活性始终处于较高水平，显著高于其他砧木。M9 和22#46的SOD活性总体来说处于相对较低水平。
图2 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化
Fig.2 Changes of superoxide dismutase(SOD)activity in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
（2）过氧化物酶（POD）活性的变化。自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中POD 活性变化如图3 所示。各苹果砧木枝条POD 活性变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020年11月7日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的POD含量活性随之升高，且各苹果砧木均在1 月份温度胁迫最严重时POD活性升至最高。在2021年1月5日至2021 年3 月5 日气温逐渐回升时，随着低温胁迫的减轻，各苹果砧木枝条POD活性有所降低。在整个自然越冬胁迫过程中，100、147和9-3的POD活性始终处于较高水平，显著高于其他砧木。M9 和MM106 的POD 活性一直处于较低水平，显著低于其他砧木。
图3 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条过氧化物酶活性（POD）的变化
Fig.3 Changes of peroxidase activity(POD)in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
（3）超氧阴离子（O2-）产生速率的变化。自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中O2-产生速率变化如图4所示。各苹果砧木枝条O2-产生速率变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020年11月7日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的O2-产生速率呈升高趋势，且各苹果砧木均在1 月份温度胁迫最严重时O2-产生速率加快，升至最高。在2021年1月5日至2021年3月5日气温逐渐回升时，随着低温胁迫的减轻，各苹果砧木枝条O2-产生速率有所降低。在整个自然越冬胁迫过程中，100 和147 的O2-产生速率始终处于较低水平，显著低于其他砧木。M9、22#46 和MM106 的O2-产生速率总体来说处于相对较高水平。
图4 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条超氧阴离子（O2-）产生速率的变化
Fig.4 Changes of superoxide anion(O2-)production rate in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
2.3.3 渗透调节物质含量的变化（1）可溶性糖含量的变化。自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中可溶性糖的含量变化如图5所示。各苹果砧木枝条可溶性糖含量变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020 年11 月7 日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的可溶性糖含量呈升高趋势，且各苹果砧木均在1月份温度胁迫最严重时可溶性糖含量升至最高。在2021 年1 月5 日至2021 年3 月5 日气温逐渐回升时，随着低温胁迫的减轻，各苹果砧木枝条可溶性糖含量有所降低。在整个自然越冬胁迫过程中，100和147的可溶性糖含量总体来说处于相对较高水平。22#46 和MM106 的可溶性糖含量一直处于较低水平，显著低于其他砧木。
图5 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条可溶性糖含量的变化
Fig.5 Changes of soluble sugar content in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
（2）可溶性蛋白含量的变化。自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中可溶性蛋白含量的变化如图6所示。各苹果砧木枝条可溶性蛋白含量变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020年11月7日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的可溶性蛋白含量随之升高，且各苹果砧木均在1 月份温度胁迫最严重时可溶性蛋白含量升至最高。在2021年1月5日至2021年3月5日气温逐渐回升时，随着低温胁迫的减轻，各苹果砧木枝条可溶性蛋白含量有所降低。在整个自然越冬胁迫过程中，100和147的可溶性蛋白含量总体来说处于较高水平。M9、22#46 和MM106 的可溶性蛋白含量一直处于较低水平，显著低于其他砧木。
图6 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条可溶性蛋白含量的变化
Fig.6 Changes of soluble protein content in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
（3）脯氨酸含量的变化。自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中脯氨酸含量的变化如图7所示。大多数苹果砧木枝条脯氨酸含量变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020年11月7日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的脯氨酸含量随之升高，在2021年1月5日至2021年3月5日随着自然冬季气温的回升，低温胁迫减轻，脯氨酸含量有所降低。100、22#46和9-3的脯氨酸含量变化略有差异，在整个越冬胁迫中脯氨酸含量持续升高，且在3 月份脯氨酸含量升至最高。SH40、MM106、M9、GM256、147 和1-8 均在1 月份温度胁迫最严重时脯氨酸含量升至最高，且各砧木间表现出显著差异。在整个自然越冬胁迫过程中，100和147的脯氨酸含量总体来说处于相对较高水平。M9、22#46 和MM106的脯氨酸含量总体来说处于相对较低水平。2.3.4 淀粉含量的变化 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中淀粉含量变化如图8所示。各苹果砧木枝条淀粉含量变化与自然冬季气温变化趋势相对应，呈先降低后升高的趋势。即在2020 年11 月7 日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的淀粉含量随之降低，且各苹果砧木均在1月份温度胁迫最严重时淀粉含量降至最低。在2021 年1 月5 日至2021 年3 月5 日气温逐渐回升时，随着低温胁迫的减轻，各苹果砧木枝条淀粉含量有所升高。在整个自然越冬胁迫过程中，100、147 和22#46 的淀粉含量总体来说处于相对较高水平。MM106 的淀粉含量总体来说处于相对较低水平。
图7 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条游离脯氨酸含量的变化
Fig.7 Changes of free proline content in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
图8 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条淀粉含量的变化
Fig.8 Changes of starch content in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
2.3.5 脱落酸（ABA）含量的变化 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条中ABA 的含量变化如图9 所示。大多数苹果砧木枝条ABA 含量变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。即在2020年11月7日至2021年1月5日随自然温度的下降和低温胁迫的加剧，各苹果砧木枝条的ABA含量随之升高，在2021年1月5日至2021年3月5日随着自然冬季气温的回升，低温胁迫减轻，ABA 含量有所降低。100、M9 和GM256 的ABA 含量变化略有差异。100 在整个越冬胁迫中ABA 含量持续降低，M9 和GM256 则呈先降低后升高随后又降低的趋势。在整个自然越冬胁迫过程中，100 和147 的ABA 含量始终处于较高水平。22#46、MM106 和GM256的ABA含量总体来说处于相对较低水平。
图9 自然越冬胁迫下各苹果砧木枝条脱落酸（ABA）含量的变化
Fig.9 Changes of abscisic acid(ABA)content in branches of apple rootstocks under natural overwintering stress
2.4 各苹果砧木枝条抗寒性的综合评价
2.4.1 苹果砧木枝条各指标的主成分因子得分分析 利用SPSS 标准数据主成分分析得到主成分特征植（表4）和主成分初始因子载荷矩阵（表5）。由表4 所示，利用SPSS 选择了特征植大于1 的前3 个主成分，且前3 个主成分的累计贡献率达到76.881%，包含了所测定的11个指标的大部分信息，所以主要提取前3 个主成分来综合分析比较9 个苹果砧木的抗寒性。由表5可知，主成分1主要反映可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、半致死温度、冻害指数、超氧阴离子产生速率和丙二醛含量6 个变量的信息。主成分2 主要反映SOD 活性、POD 活性、脯氨酸和ABA含量4个变量的信息。主成分3主要反映淀粉含量的信息。
表4 主成分特征值
Table 4 Component eigenvalue
主成分Principal component 123初始特征植Initial eigenvalue特征根Characteristic root 4.676 2.217 1.563贡献率Contribution rate/%42.513 20.159 14.209累积贡献率Cumulative contribution rate/%42.513 62.673 76.881
表5 主成分初始因子荷载矩阵
Table 5 Component matrix
生化指标Biochemical indexes可溶性糖含量Soluble sugar content可溶性蛋白含量Soluble protein content半致死温度LT50超氧阴离子产生速率O2-production rate冻害指数Freezing injury index丙二醛含量MDA content超氧化物歧化酶活性SOD activity脱落酸含量ABA content脯氨酸含量Proline content过氧化物酶活性POD activity淀粉含量Starch content主成分1 Component one 0.903主成分2 Component two 0.272主成分3 Component three 0.078 0.891 0.040 0.341-0.863 0.763-0.341-0.361 0.084-0.181 0.704 0.691-0.059-0.339-0.576 0.684-0.436 0.129-0.640-0.095 0.489 0.437-0.570 0.678 0.537 0.480 0.055-0.209 0.316 0.477 0.644
2.4.2 苹果砧木抗寒性综合评价 由特征植与初始因子计算得出各主成分特征向量植，特征向量植再与标准化后的原始数据计算得出各主成分植，再根据各个主成分所占贡献率求得综合得分，最后根据综合得分的植判断其抗寒力强弱，得分植越高表示抗寒力越强[14]。评价结果如表6 所示，各苹果砧木品种抗寒性的强弱顺序为：100 ＞147 ＞9-3 ＞GM256 ＞SH40 ＞1-8 ＞22#46 ＞M9 ＞MM106。
表6 各苹果砧木主成分值和抗寒力排序
Table 6 Main component values and cold resistance ranking of apple rootstocks
砧木Stock主成分植Component value主成分1 Component 1主成分2 Component 2主成分3 Component 3综合得分Comprehensive score抗寒力排序Cold resistance sorting 100 9-3 147 GM256 SH40 1-8 MM106 M9 22#46 0.156 341 0.609 578-0.318 850-0.591 010-1.022 850 0.105 706-0.724 440-0.031 600 1.817 088 9.705 602 1.167 378 6.392 314 1.421 754 1.032 363-2.958 900-4.713 030-2.893 480-9.153 970 1.907 879 1.828 509 2.223 145 0.493 033-1.198 820-0.678 740-4.903 460-2.640 380 2.968 858 2.294 108 0.754 294 1.468 962 0.105 412-0.397 070-0.647 990-1.954 810-0.971 900-0.651 010 132456987
3 讨 论
3.1 组织褐变法与枝条抗寒性的关系
组织褐变法是目前鉴定植物抗寒性和描述冻害形态指标常用的方法[19]。本研究中，随温度降低，各苹果砧木枝条的冻害指数升高，褐变程度加重。这与高爱农等[20]研究结果一致。本研究中，100、147、9-3和GM256的冻害指数相对较低，褐化情况较轻，说明抗寒性强；MM106、M9 和22#46 冻害指数较高，褐化情况相对较重，说明抗寒性较差。这一研究结果与半致死温度所得结果一致。
3.2 丙二醛（MDA）含量与抗寒性的关系
Campos等[21]认为，低温胁迫下，可通过MDA含量的变化判断细胞膜受损伤程度和判断植物的抗寒性。本研究中，在整个自然越冬胁迫条件下，随自然气温的降低加剧了膜脂过氧化作用，MDA 含量增加，温度最低时，MDA 含量最大。抗寒性弱的22#46的MDA含量一直处于较高水平，抗寒性强的100和147的MDA含量较其他苹果砧木均始终处于较低水平。这与范宗民等[22]和刘兴禄等[23]研究结果一致。
3.3 抗氧化系统与抗寒性的关系
正常情况下，植物体内的活性氧含量处于动态平衡阶段，但遇到低温胁迫后会加重生物体内超氧阴离子自由基等活性氧的积累，引起体内活性氧清除系统失衡，导致膜脂过氧化作用加剧而使植物受伤害[24]，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）是植物体内的重要保护酶，能够清除活性氧和自由基，防止脂膜过氧化，使植物免受损伤[25]。本研究中，在自然越冬胁迫条件下，抗寒性强的砧木有较高的SOD 和POD 酶活性和较低的超氧阴离子含量，抗寒性差的砧木有较低的SOD、POD 保护酶活性和较高的超氧阴离子产生速率。这与田景花等[26]研究结果相同。
3.4 渗透调节物质含量与抗寒性的关系
脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物中最常见的渗透调节物质[27]，植物能够调节自身的渗透调节物质含量来应对逆境低温伤害[28]。本研究中，在自然越冬胁迫条件下，各苹果砧木枝条的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量变化与自然冬季气温变化趋势相反，呈先升高后降低的趋势。且抗寒性强的100和147枝条中均始终有较高的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量。说明在低温胁迫下，这些渗透物质的增加能够提高植物的抗寒性，且渗透调节物质含量高的砧木抗寒性好。这与王飞雪[29]和王海鸥等[8]的研究结果一致。
3.5 淀粉含量与抗寒性的关系
淀粉主要通过与可溶性糖等物质的相互转化间接影响植物的抗寒性[30]。本研究中，在自然越冬胁迫条件下，淀粉含量随气温的降低而降低，在气温回升时又有所升高。说明在低温胁迫下，各苹果砧木需要淀粉转化为糖来提供的能量抵抗寒冷，所以呈现下降趋势。这一变化规律与王丽雪等[31]和杨雪[11]的研究结果一致，但与代汉萍等[32]的研究结果不一致，可能与试验材料不一样有关，不同品种对低温的适应性不同。本研究中，100、147和22#46的淀粉含量处于相对较高水平，且100和147的可溶性糖含量也较高，说明100和147抗寒性较好。22#46虽然淀粉含量较高，但其可溶性糖含量较低，因此，并不能说明22#46 抗寒性强。MM106 的淀粉含量处于相对较低水平，且可溶性糖含量也低，说明抗寒性较差。
3.6 脱落酸（ABA）含量与抗寒性的关系
低温胁迫下，植物能够增加自身的ABA含量来抑制生长，从而使其更好地适应低温环境，提高抗寒性[33]。本研究中，在整个自然越冬胁迫条件下，ABA含量随气温的降低而升高，且抗寒性强的100和147的ABA含量较其他苹果砧木一直处于较高水平，而抗寒性弱的22#46 和MM106 的ABA 含量较其他苹果砧木一直处于较低水平。这与袁月等[34]的研究结果一致。
3.7 主成分分析综合评价抗寒性
影响植物抗寒性的因素有很多，因此不能凭单个或少数几个指标下定论，主成分分析是一种可以综合多个指标的贡献植来判断抗寒性的综合评价方法。运用主成分可以降低多因素之间的影响，能够可靠的反映植物的抗寒性[35]。因此，笔者在本研究中运用主成分分析的方法结合11个指标对9种苹果砧木做出抗寒性综合评价。
4 结 论
通过测定9 种苹果中间砧的1 年生休眠枝条在自然越冬低温胁迫下的生理指标的变化，结果显示：抗寒性强的中间砧有较高的SOD、POD 酶活性和ABA、可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉和脯氨酸含量，以及较低的冻害指数、MDA 和超氧阴离子产生速率。对测定指标进行主成分分析综合评价，各苹果中间砧的抗寒性由强到弱的顺序为：100 ＞147 ＞9-3 ＞GM256 ＞SH40 ＞1-8 ＞22#46 ＞M9 ＞MM106。
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