核桃（Juglans regia L.），又称胡桃、羌桃、万岁子等，为胡桃科（Juglandaceae）核桃属（Juglans）落叶乔木，果实营养价值很高，为“世界四大干果”（核桃、扁桃、腰果、榛子）之一[1]。核桃坚果的种仁外有一层呈黄色或浅黄色的内种皮，占种仁质量的5%左右，它可以阻止种仁的氧化酸败，对核桃果实生长发育及采后品质的保持起着非常重要的作用[2-3]。核桃内种皮富含多酚类物质，对核桃种仁的口感起着关键作用，也是核桃仁中对人体健康起主要作用的部位之一，但由于其具有一定的苦涩味，再加上其干制后颜色加深并伴随一定程度的褐变现象[4-5]，因此在食品加工过程中会被剔除或者经脱涩后再加工，造成资源浪费。
苦涩味是由单宁等酚类物质与唾液蛋白之间的相互作用引起的。在苦涩味成分的研究中，主要集中在酚酸类组分、儿茶素组分、生物碱组分、氨基酸组分等物质[6]。目前，苦涩味物质的研究主要集中在茶、柿子等植物[7-10]，其中茶叶涩味主体物质是儿茶素类物质，儿茶素是茶多酚类的主体物质[7]，柿单宁的主要成分是儿茶素和没食子酸[8]，黄瓜中主要涩味物质为儿茶素类物质[9]，乜兰春等[10]研究认为引起苹果果实涩感的主要物质是绿原酸、儿茶素、表儿茶素和原花青素。目前，核桃的有关研究主要是对其酚类物质及其组分含量的测定上[11-12]，在核桃果实苦涩味方面的研究较少[13-14]。俞文君等[13]对38份核桃资源7个呈苦涩味指标的研究得出单宁是核桃果实中的主要苦涩味物质；刘雨霞等[14]利用电子舌系统对具有不同程度苦涩味的核桃内种皮口感品质进行了分类评价，将核桃内种皮分为苦涩味较重、苦涩味略重和苦涩味轻三类，但是这些研究并没有对核桃内种皮的苦涩味物质进行系统全面的分析。笔者实验室前期利用感官评价和电子舌测定对鲜核桃内种皮的苦涩味进行分类评价，通过主成分分析和聚类分析的结果发现分为三类：苦涩味较重的品种、苦涩味略重的品种和苦涩味轻的品种。笔者基于本实验室前期筛选出的5 个不同程度苦涩味（较重、略重、轻）的核桃品种，通过对其内种皮的总单宁、酚酸类组分、黄酮类组分和生物碱组分等苦涩味物质的含量进行测定，并进行相关性和主成分分析，旨在找出对核桃内种皮苦涩味起关键作用的功能物质，以期为筛选低苦涩味核桃品种以及核桃口感品质研究等方面提供理论参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为‘中林3 号’（苦涩味较重），‘薄壳香’‘香玲’和‘京861’（苦涩味略重），‘农核1号’（苦涩味轻）5个核桃品种的新鲜内种皮，采于山西省晋中市太谷区山西农业大学（山西省农业科学院）果树研究所核桃资源圃（112°33′N、37°25′E）。试验地土质沙壤土，肥力中等、管理良好、光照充足。采样所挑选的植株树龄为10 a，生长健壮、无病虫害。于2019 年9 月上旬采集成熟度一致的果实，从植株的东、西、南、北四个方向各采集50 个果实混匀，放入冰盒中带回实验室，将采回的鲜核桃迅速剥去青皮和硬壳，用镊子将内种皮从种仁上剥下，经冷冻干燥后研成粉末，于-40 ℃条件下干燥保存。
1.2 试验方法
1.2.1 样品处理 称取0.1 g内种皮粉末，加入一定量60%（φ）的乙醇溶液，50 ℃超声波辅助提取30 min，10 000 r·min-1离心10 min，2 次重复，合并上清液，定容，待紫外分光光度计测定。称取0.1 g 内种皮粉末，加入一定量50%的甲醇溶液，50 ℃超声波辅助提取30 min，10 000 r·min-1离心10 min，2 次重复，合并上清液，定容，待HPLC测定。
1.2.2 总单宁含量的测定 总单宁含量的测定参照罗玉洁[15]的方法，稍作修改。取0.1 mL提取液到10 mL容量瓶，分别加入0.5 mL福林酚试剂和1 mL饱和碳酸钠溶液，用蒸馏水定容后室温避光静置反应1 h，在725 nm 波长下测定样品溶液的吸光度，3 次重复。标准曲线回归方程为：y= 0.079 9x + 0.000 3，R²=0.999 3。
1.2.3 酚酸组分含量的测定 参照卢文青等[16]的方法，稍作修改。色谱条件：采用Hypersil GOLD C18 column（250 mm×4.6 mm，粒径5 μm）色谱柱。流动相A 为甲酸溶液（0.02%，v/v），B为甲醇溶液（100%，φ）。柱温：25 ℃，流速：0.8 mL·min-1，进样量：10 μL，检测波长：280 nm、320 nm。洗脱梯度为：0～5 min：90%A～80%A；5～10 min：80%A～65%A；10～20 min：65%A～60%A；20～35 min：60%A～25%A；35～40 min：25%A～10%A；40～45 min：10%A～10%A。
1.2.4 芦丁含量的测定 参照徐文平[17]的方法，稍作修改。色谱条件：采用Hypersil GOLD C18 column（250 mm×4.6 mm，粒径5 μm）色谱柱。流动相A 为乙酸溶液（0.2%，φ），B 为乙腈溶液（100%，φ）。柱温：25 ℃，流速：0.8 mL·min-1，进样量：10 μL，检测波长：360 nm。洗脱梯度为：0～4 min：92%A～92%A；4～10 min：92%A～79%A；10～15 min：79%A～71%A；15～16 min：71%A～71%A；16～23 min：71%A～60%A；23～28 min：60%A～60%A；28～32 min：60%A～92%A；32～35 min：92%A～92%A。
1.2.5 没食子酸、儿茶素组分和生物碱的测定 参照杨金川等[18]的方法，稍作修改。色谱条件：色谱柱同上。流动相A 为乙酸溶液（0.5%，φ），B 为乙腈溶液（100%，φ），C 为甲醇溶液（100%，φ）。柱温：25 ℃，流速：0.8 mL·min-1，进样量：10 μL，检测波长：280 nm。洗脱梯度为：A∶B∶C=88∶4∶8，保持3 min；7 min 内流动相比例改变为85∶5∶10；15 min 内流动相比例改变为70∶10∶20；5 min 内流动相比例改变为72∶8∶20，保持2 min；3 min 内流动相比例改变为88∶4∶8，保持5 min，共40 min。
1.2.6 感官评价 参照邹运乾等[19]的方法，随机招募10名志愿者组成感官评价的测试人员，每次评价时不同品种随机选取10个果实做好标记，将内种皮剥下混匀。评价指标包括苦味和涩味，评分标准为5个等级：不苦/涩0～2分，微苦/涩2～4分，较苦/涩4～6分，苦/涩6～8分，极苦/涩8～10分，将评分的平均值作为内种皮苦涩味强度的最终值。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excle 2016 和Origin Pro 9 进行整理数据和作图，利用SPSS 23.0 软件采用Pearson相关系数法进行相关性分析，利用SAS 8.0 软件采用Duncan 新复极差法进行显著性分析和主成分分析。
2 结果与分析
2.1 不同核桃品种内种皮总单宁的含量分析
单宁等酚类物质具有苦涩味，总单宁含量在一定程度上可以反映苦涩味程度。由图1 可知，总单宁含量在不同苦涩程度核桃内种皮上存在明显差异。总单宁含量（w，后同）以‘中林3 号’最高（726.03 mg·g-1），‘京861’（651.81 mg·g-1）、‘香玲’（651.31 mg·g-1）、‘薄壳香’（539.26 mg·g-1）居中，‘农核1 号’最低（277.56 mg·g-1）。‘中林3 号’的单宁含量是‘农核1号’的2.62倍。‘中林3号’的单宁含量显著高于其他品种（p ＜0.05）。结果表明，从总单宁含量上来说，‘中林3号’的苦涩味强度最高，‘农核1号’最低，其他3个品种居中。
图1 不同核桃品种内种皮总单宁含量
Fig.1 The total tannin content in the pellicle of different cultivar of walnut
不同小写字母表示不同品种间的差异显著（p ＜0.05）。
Different small letters indicate significant difference at p ＜0.05.
2.2 不同核桃品种内种皮酚类物质和生物碱组分的含量分析
5个核桃品种的酚类物质和生物碱各组分含量差异明显（表1），对5个核桃品种内种皮共检测了16种酚类物质（酚酸类8种，包括没食子酸、绿原酸、香草酸、丁香酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、鞣花酸；黄酮类8 种，包括芦丁、C、EC、GC、EGC、ECG、GCG、EGCG）和3种生物碱（咖啡碱、可可碱、茶碱）。除了可可碱在所有核桃品种的内种皮中均未被检测到外，各个组分均可检测到。
表1 不同核桃品种内种皮苦涩味物质含量
Table 1 Contents of bitter and astringent substances in the pellicle of different walnut cultivar
注：“-”表示未检出；表中数值为平均值±标准偏差；同一行中带有不同小写字母的数值之间差异显著（p ＜0.05）。
Note:“-”means not detected; the values in the table are the average ± standard deviation; the values with different lowercase letters in the same column have significant differences(p ＜0.05).
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没食子酸、绿原酸等酚酸类物质具有苦涩味，其苦涩味强度随浓度增加而增强。由表1 可知，核桃内种皮在酚酸组分的含量存在差异，酚酸组分中含量最高的是没食子酸，最低的是丁香酸，酚酸组分含量由高到低为没食子酸＞咖啡酸＞绿原酸＞阿魏酸＞香草酸＞鞣花酸＞对香豆酸＞丁香酸。不同核桃品种在各个酚酸组分上也存在一定差异，没食子酸含量最大值为1 171.26 mg·100 g-1、最小值为431.44 mg·100 g-1，‘京861’的没食子酸含量显著高于其他品种（p＜0.05）；绿原酸含量最大值为363.60mg·100g-1、最小值为114.60 mg·100 g-1，‘中林3号’的绿原酸含量显著高于其他品种（p ＜0.05）；香草酸含量最大值为178.75 mg·100 g-1、最小值为89.51 mg·100 g-1，‘香玲’的香草酸含量显著高于其他品种（p ＜（mg·100g-1）0.05）；丁香酸含量最大值为39.95 mg·100 g-1、最小值为20.09 mg·100 g-1，‘中林3号’和‘京861’的丁香酸含量显著高于其他品种（p ＜0.05）；咖啡酸含量最大值为334.57 mg·100 g-1、最小值为184.26 mg·100 g-1，‘中林3号’和‘京861’的咖啡酸含量显著高于其他品种（p ＜0.05）；对香豆酸含量最大值为48.60 mg·100 g-1、最小值为47.99 mg·100 g-1，‘中林3 号’的对香豆酸含量显著高于其他品种（p ＜0.05）；阿魏酸含量最大值为219.05 mg·100 g-1、最小值为124.78 mg·100 g-1，‘中林3号’的阿魏酸含量显著高于其他品种（p ＜0.05）；鞣花酸含量最大值为131.47 mg·100 g-1、最小值为37.97 mg·100 g-1，‘中林3 号’的鞣花酸含量显著高于其他品种（p ＜0.05）。因此，从酚酸组分含量上来说，‘中林3号’的苦涩味强度显著高于其他品种。
芦丁自身没有明显的滋味，但是它有增强咖啡碱苦味的作用。由表1 可知，芦丁的含量在不同品种核桃内种皮上均存在差异。芦丁含量最大值为301.55 mg·100 g-1、最小值为122.33 mg·100 g-1。‘香玲’‘中林3号’和‘京861’的芦丁含量显著高于其他品种。结果表明，从芦丁含量上来说，‘香玲’‘中林3 号’和‘京861’的苦涩味强度显著高于其他品种。儿茶素具有苦涩味，其中酯型儿茶素是引起苦涩味的主要因素，酯型儿茶素中的EGCG 是引起苦涩味的关键物质。由表1 可知，核桃内种皮在儿茶素组分含量的配比上存在差异，儿茶素组分中含量最高的是C，最低的是ECG，儿茶素组分含量由高到低为C＞EGC＞EGCG＞GC＞GCG＞EC＞ECG。 不同品种的儿茶素总量也存在差异，儿茶素总量由高到低为‘中林3 号’＞‘京861’＞‘薄壳香’＞‘香玲’＞‘农核1号’。不同品种的酯型儿茶素和非酯型儿茶素总量也存在差异，酯型儿茶素总量由高到低为‘中林3 号’＞‘香玲’＞‘京861’＞‘薄壳香’＞‘农核1号’，非酯型儿茶素总量由高到低为‘中林3 号’＞‘薄壳香’＞‘京861’＞‘农核1 号’＞‘香玲’。不同品种的EGCG 含量也存在差异，EGCG 含量由高到低为‘中林3 号’＞‘香玲’＞‘薄壳香’＞‘京861’＞‘农核1 号’。‘京861’的C 含量显著高于其他品种（p ＜0.05），‘中林3 号’的EC、EGC、ECG 含量显著高于其他品种（p ＜0.05），‘中林3号’和‘薄壳香’的GC 含量显著高于其他品种（p ＜0.05），‘中林3 号’的GCG含量显著高于其他品种（p ＜0.05），‘中林3号’和‘香玲’的EGCG含量显著高于其他品种（p ＜0.05）。因此，儿茶素组分方面，‘中林3号’最高，‘农核1号’最低，其他3个品种居中。结果表明，从儿茶素含量上来说，‘中林3号’和‘京861’的苦涩味强度显著高于其他品种。
咖啡碱是单一的苦味物质，阈值较低，其含量越高对核桃内种皮的苦味贡献率越高。茶碱也呈现苦味，但与咖啡碱相比苦味较弱。由表1可知，核桃内种皮在生物碱组分的含量存在较大差异，各个品种的咖啡碱含量明显高于茶碱。咖啡碱含量最大值为956.77 mg·100 g-1、最小值为246.03 mg·100 g-1。茶碱含量最大值为23.43 mg·100 g-1、最小值为4.96 mg·100 g-1。‘薄壳香’的咖啡碱含量显著高于其他品种（p ＜0.05），‘中林3号’的茶碱含量显著高于其他品种（p ＜0.05）。不同品种的生物碱总量存在差异，生物碱总量由高到低为：‘薄壳香’＞‘香玲’＞‘中林3号’＞‘京861’＞‘农核1号’。结果表明，从生物碱含量上来说，‘中林3 号’和‘薄壳香’的苦味强度显著高于其他品种，‘农核1号’的苦味最轻。
2.3 核桃内种皮苦涩味物质与口感评价的相关性分析
为了探究苦涩味物质与口感评价（苦味、涩味）之间的相关性，利用Pearson相关系数对其进行相关性分析，结果如表2所示。所有苦涩味物质与苦味、涩味之间均呈正相关，表明随着所有苦涩味物质含量的增加，苦味和涩味也随之增加。GC与苦味呈极显著正相关，对香豆酸、EC、ECG与苦味呈显著正相关，表明随着GC、对香豆酸、EC、ECG 含量的增加，苦味也随之增加；总单宁、EC与涩味呈显著正相关，表明随着总单宁、EC 含量的增加，涩味也随之增加。由此可知，本研究所检测的所有苦涩味物质对苦涩味均有贡献，其中GC、对香豆酸、EC和ECG对苦味的贡献较大，总单宁和EC对涩味的贡献较大。
表2 苦涩味物质与口感评价的相关性分析
Table 2 Correlation analysis between bitter and astringent substances and taste evaluation
注：*表示0.05 水平上的相关性，**表示0.01 水平上的相关性。
Note: * indicates significant correlation at p ＜0.05 level，** indicates significant correlation at p ＜0.01 level.
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2.4 核桃内种皮苦涩味物质的主成分分析
对5个核桃品种内种皮18个苦涩味物质的含量进行主成分分析，第1 主成分的特征值为11.070 9，贡献率为58.27%，代表了所有苦涩味物质的58.27%的信息；第2 主成分的特征值为4.713 8，贡献率为24.81%，累积贡献率为83.08%。2 个主成分的累计贡献率为83.08%，接近85%（常用阈值），包含了苦涩味指标83.08%的信息，因此可将第1 主成分和第2主成分作为比较各个核桃品种内种皮苦涩味特点的尺度。
由图2可知，第1主成分的权（特征向量）均为正数，表明第1 主成分可以代表苦涩味指标的整体信息，可解释为“总苦涩味”因子。第2 主成分的权中绝对值较大的正权是对香豆酸、GC、EGC、咖啡碱，绝对值较大的负权是没食子酸、芦丁、C 和GCG，前者为苦味较重物质，后者为涩味较重物质，第2主成分的值依赖于苦味物质与涩味物质的比例，苦味物质与涩味物质的比例越大，则主成分值越大，反之越小，故第2 主成分可以解释为“苦涩结构”因子。从主成分分析的结果可以看出总单宁、绿原酸、鞣花酸、EC、GC、EGCG、咖啡碱等物质基本包含了核桃内种皮苦涩味信息。
图2 苦涩味物质主成分分析的权分布图
Fig.2 Weight distribution diagram of principal component analysis of bitter and astringent substances
TT.总单宁；CHA.绿原酸；VA.香草酸；SA.丁香酸；CA.咖啡酸；PCA.对香豆酸；FA.阿魏酸；EA.鞣花酸；GA.没食子酸；R.芦丁；C.儿茶素；EC.表儿茶素；GC.没食子儿茶素；EGC.表没食子儿茶素；ECG. 表儿茶素没食子酸酯；GCG. 没食子儿茶素没食子酸酯；EGCG.表没食子儿茶素没食子酸酯；CAF.咖啡碱；TP.茶碱。
TT.Total tannins;CHA.Chlorogenic acid;VA.Vanillic acid;SA.Syringic acid; CA. Caffeic acid; PCA. P-coumaric acid; FA. Ferulic acid;EA. Ellagic acid; GA. Gallic acid; R. Rutin; C. Catechin; EC. Epicatechin; GC. Gallocatechin; EGC. Eepigallocatechin; ECG. Epicatechin gallate; GCG. Gallocatechin gallate; EGCG. Epigallocatechin gallate;CAF.Caffeine;TP.Theophylline.
由图3 可知，5 个核桃品种按第1 主成分的值（得分）排序，值较小的品种是‘农核1号’‘薄壳香’，说明这两个品种苦涩味较轻；值最大的品种是‘中林3 号’，说明这个品种苦涩味最重。5 个核桃品种按第2主成分的值（得分）排序，值较小的品种是‘农核1 号’‘香玲’和‘京861’，说明这三个品种的涩味大于苦味；值最大的品种是‘薄壳香’，说明这个品种的苦味大于涩味。
图3 主成分分析得分图
Fig.3 Principal component score chart
3 讨 论
苦涩味主要来自单宁和其他多酚类化合物，是由单宁等多酚类物质与唾液蛋白之间的相互作用引起的[20]。罗晓文等[21]认为单宁和儿茶素类物质是决定果实涩味的关键因素。白蓝[22]认为食物的涩味主要来自鞣质（单宁），在一些水果蔬菜中草酸、香豆素类、奎宁酸等物质也能引起涩味。夏勃[23]认为核桃中的苦味和涩味物质主要成分是单宁。在本研究中，口感评价苦涩味最重的品种总单宁含量也最高，反之则最低，这与上述研究结果一致，从而可以得出单宁是造成核桃内种皮苦涩味的关键物质。
没食子酸和绿原酸具有苦涩味，其苦涩味强度随浓度增加而增强[24]。陆胜波等[25]对‘黔核6 号’和‘黔核7号’内种皮酚酸类含量的测定发现规律并不相同，‘黔核6号’的没食子酸含量最高，‘黔核7号’的绿原酸含量最高，万政敏等[26]的研究得出没食子酸是酚酸类中含量最高的，在本研究中酚酸类组分中含量最高的是没食子酸，说明酚酸类组分在核桃内种皮中的分布因品种而异，但是没食子酸和绿原酸在酚酸类组分中是含量较高的。在本研究中阿魏酸含量（124.78～219.05 mg·100 g-1）和鞣花酸含量（37.97～131.47 mg·100 g-1）较低，但是在主成分分析得出阿魏酸和鞣花酸对苦涩味贡献较大，表明阿魏酸和鞣花酸也是重要的苦涩味物质。
儿茶素是影响果实苦涩味的主要物质之一，广泛分布于自然界各种食品和药物中[27]。儿茶素同时具有苦味和涩味，其中苦味强度大于涩味。儿茶素分为酯型（复杂）儿茶素和非酯型（简单）儿茶素，酯型儿茶素是引起苦涩味的主要因素，非酯型儿茶素涩味不重，酯型儿茶素中的EGCG 是引起苦涩味的关键物质[28]。‘中林3号’的儿茶素总量、酯型儿茶素总量和EGCG 含量均高于其他品种，表明‘中林3号’的苦涩味强度高于其他品种；相反，‘农核1 号’的儿茶素总量、酯型儿茶素总量和EGCG 含量均低于其他品种，表明‘农核1 号’的苦涩味强度低于其他品种，这与唐琴等[29]在尤溪苦茶上的研究结果一致。
咖啡碱是单一苦味物质，但是其苦涩味阈值低于儿茶素，咖啡碱和EGCG之间具有苦味协同作用，且咖啡碱对EGCG的涩味具有增强作用[30]。在本研究中，咖啡碱含量明显高于茶碱含量，虽然‘薄壳香’的咖啡碱含量最高，但是它在苦涩味感官评价中却是较轻的，这可能与咖啡碱阈值低有关系。另外，‘农核1 号’的咖啡碱含量是最低的，单从咖啡碱含量上来说，‘农核1号’仍是苦味最轻的。
果实中的苦涩味物质对于人类的健康有积极作用。研究表明，单宁等多酚类物质具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎和抗癌等功效[31-32]。但是，果实的苦涩味会影响其食用品质，轻度苦涩味会丰富食物的口感，重苦涩味往往会引起人们的不适，因此具有重苦涩味的食物不受消费者喜欢。核桃内种皮是核桃各部位中酚类物质含量最高的部位，这也是其产生苦涩味的主要原因，将内种皮去除后，核桃仁口感将会香甜爽口，但是对人体有益的酚类物质就会损失掉，造成资源的浪费，因此找到内种皮苦涩味轻的核桃品种是至关重要并且需要迫切解决的事情。通过本实验室前期对鲜核桃的感官评价和本研究对核桃内种皮苦涩味物质含量的测定，发现‘农核1 号’的苦涩味最轻，因此可以将其作为核桃苦涩味研究以及育种的重要材料，并将其进行推广栽植以满足消费者的需求。
4 结 论
本研究结果表明：总单宁、绿原酸、EC、GC、EGCG和咖啡碱等是影响核桃内种皮苦涩味的主要物质；在苦涩味强度上，‘中林3号’最高，‘农核1号’最低，其他三个品种居中，与感官评价结果基本一致。这为今后核桃内种皮口感品质以及筛选低苦涩味的核桃品种等方面的研究提供了启发。
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